本协议详细介绍了可用于转化生物标志物分析的临床试验现场高质量PBMC和血浆生物采样剂的临床可实施制备。
对周围血液中生物标志物的分析在临床试验中变得越来越重要,以建立评估治疗效果的机制证明,并帮助指导治疗剂量和计划设置。从单次抽血中,可以分离和处理外周血单核细胞,分析和量化蛋白质标记物,血浆样本可用于分析循环肿瘤DNA、细胞因子和血浆代谢学。治疗的纵向样本提供了有关给定蛋白质标记物的进化、突变状态和患者免疫学景观的信息。只有有效地在临床部位进行外周血液的处理,并且从床边到长凳上适当保存样本,才能实现这一点。在这里,我们提出了一个优化的通用协议,可以在临床现场实施,在多中心临床试验中获取PBMC颗粒和血浆样本,这将使医院实验室的临床专业人员能够成功提供高质量的样品,无论他们的技术专长水平如何。还介绍了替代协议变体,这些变体针对更具体的下游分析方法进行了优化。我们应用此协议研究蛋白质生物标志物对 X 射线辐照血液中的 DNA 损伤反应 (DDR),以证明该方法在采用 DDR 药物和/或放射治疗的肿瘤学环境中以及在需要机械假说测试的临床前阶段是否合适。
药物开发旨在提供新的治疗方法,满足未满足的医疗需求和更有针对性的个性化药物。多种药物机制正在积极研究,包括酶抑制,如激酶1,蛋白酶2,或聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂3,蛋白质降解剂4,治疗抗体5,抗体结合药物(ADCs)6等。在肿瘤学中获得更好治疗的一个例子是使用激酶抑制剂,目的是阻止信号级联,使癌细胞增殖1,7。测量这些激酶特有的基质磷酸化水平是量化这些抑制剂8作用机制的最佳药效生物标志物。其他药物可能调节给定蛋白质的表达,在这种情况下,能够在整个治疗过程中纵向量化目标蛋白质浓度的变化至关重要。因此,独立于药物或病理学的特点,评估生物标志物,以建立药物接触和目标调制之间的药动力学(PK)/药理动力学(PD)关系,是早期临床开发的最佳实践,并能够确定一个安全和耐受的药理活性剂量/时间表9。
虽然在肿瘤临床开发中,活检中的生物标志物分析可能是建立药物机制证明的最佳环境,但试验中可用活检的数量通常相当有限,为10,11。或者,外周血液样本对临床试验具有很高的价值,因为它们涉及微创程序,快速易于获得促进纵向分析,比活检便宜,并为实时监测治疗结果提供大量信息。评估外周血液中的PD生物标志物的另一个好处是能够使用生物桑普尔来量化PK,从而准确确定PK/PD定量关系和随后的PK/PD建模12,13。可以分离出全血的外周血单核细胞(PBMC)来研究蛋白质标记,这些标记体在表达水平或转化后变化中都会经历变化。此外,PBMC可用于免疫调节目的14,15,免疫功能检测,如评估抗体依赖细胞毒性(ADCC)16和表观遗传分析通过RNA隔离。同样,全血血浆可用于量化细胞因子,以描述患者的免疫反应,进行代谢研究,并分离和序列循环肿瘤DNA(ctDNA),以监测从治疗剂中选择的疾病的克隆进化,经常为治疗抗药性提供机械基础17、18、19,从而发展后代治疗20。最后,从外周血液中分离循环肿瘤细胞(CTCs),通过纵向列举、DNA/RNA测序和蛋白质-生物标志物分析21,对疾病进展进行评估。虽然这种隔离符合本22号所述的协议,但许多癌症类型和疾病早期中CTC的低丰度使得使用专门的管子更适合将CTC降解降解降解23。
近年来,液体活检的使用改善了临床试验获得的信息,PBMC收集已纳入许多研究,以监测目标参与度和机制证明,无论是直接在肿瘤细胞的某些类型的血液恶性肿瘤,或在PBMC本身作为PCD替代肿瘤细胞24,25,26。高质量样品的制备对确定特定病理学最安全、最有效的治疗方法产生了积极影响,但根据我们的经验,从不同临床地点获得的PBMC制剂的质量在质量上存在广泛差异,导致样品不适合下游分析。这影响了可从这些研究中收集的 PD 数据量。
在这里,我们详细描述了一个易于遵循的协议,展示了如何有效地将 PBMC 和血浆样本从临床环境中的单次抽血中分离。该协议基于单核细胞制备管制造商提供的说明,该说明包含了实际经验突出表明临床部位报告的协议执行困难(如离心问题、处理延迟和样品转移到低温管)的修改。有替代商业上可用的方法,使用单核细胞制备管基于密度梯度分离使用多糖溶液有或没有屏障,从血液27分离溶液。如果相关的临床站点在这些替代方法中已经经验丰富,则此协议可以与这些方法进行可接受的替代。在这种情况下,可以考虑两个因素:一些替代方法需要将全血从收集管转移到单独的制备管,在这种管中,额外的人类初级生物材料转移可能会带来轻微增加的安全风险,而方法的成功没有障碍地将血液与多糖溶液分离,则依赖于关键步骤,例如将血液样本分层到密度梯度介质上,这需要开发一种精湛的技术专长水平,这在医院的实验室环境中并非总是如此。尽管上述观点,但总体生存能力和细胞恢复能力与这些技术15、28是可比的。因此,方法的选择在某种程度上取决于以前的技术经验,但在我们的手中,单核细胞制备管可以在广泛的临床环境中成功使用,否则,我们的建议。
虽然本协议的一个终点是生产PBMC颗粒,用于进一步处理到赖苏特,但PBMC集合的其他最终应用可以实施,例如核酸的分离,或产生适用于免疫化学 (IHC) 方法的 PBMC 涂片或 PBMC 块。重要的是,由于从患者身上取出的每种生物样本至少在某种程度上代表一种侵入性过程,此协议通过分离可用于细胞因子分析、代谢学研究或 ctDNA 测序的血浆,最大限度地利用每个样本中的有用材料。
肿瘤学试验中外周生物标志物的分析是PBMC赖塞酸盐的众多应用之一。一个例子是评估DNA损伤反应(DDR)的治疗,如化疗,放疗或使用抑制剂的酶参与DDR,如磷脂二二醇-3激酶相关激酶(PIKKs)7和PARP 3,13。这些治疗的目的是增加增殖细胞的DNA损伤,在DDR机制受损的细胞和细胞周期检查点(如癌细胞)中产生高毒性。在这里,我们举了一个例子,对接受X光检查的外周血液中的DDR生物标志物进行了研究。
PBMC 和血浆的高质量制剂,可在临床试验现场进行稳健和可重复的准备,为临床试验外围预测和药效转化生物标志物终点提供宝贵信息。在这里,我们提供了一个简短而明确的协议,解决了迄今为止在临床试验环境中容易出现执行错误通常有问题的步骤。但是,可以进一步优化协议以满足特定要求,例如临床现场的时间限制或下游分析类型(参见 补充文件)。
为此,我们展示了如何利用单核细胞制备管将PBMC和血浆从全血中分离出来,以产生适合各种下游分析的冷冻PBMC颗粒和冷冻血浆。我们已提请注意特别关键的协议步骤,包括第 2.5 步中 PBMC 层的离心和识别,以及步骤 3.3 和 3.6 中的 PBMC 颗粒。从历史上看,临床部位经常出错的地方是将离心机设置为正确的单位(将RCF或 x g值与RPM值混淆),延迟血液样本的处理、温度和冷冻细胞颗粒上方大量PBS的存在。在大多数离心机转子错误地输入x g值作为 RPM 设置将导致显着离心不足,导致定义不明确或缺席 PBMC 层,以及由于低效细胞平滑在洗涤步骤期间可能无意中丢弃 PBMC。但是,尽管患者已患上白血病,则使用正确的离心设置和转子适配器,但 PBMC 层仍可能不可见。这种情况可能会影响因化疗或放射治疗而参加肿瘤学试验的患者,应予以考虑。协议中已阐明的另一个关键点是,必须在抽血后1-2小时内处理样品,以减少血液溶解对协议产生负面影响的可能性。此外,旨在处理样本在抽血的第一个小时减少前活性变异性,这可能有很大的影响,药动力学读数和生物标志物的影响,血液保存或主动信号通路,如图4中显示的情况。样品处理的延迟也会对细胞的生存能力产生有害影响,如果细胞要冷冻保存34。另一个可能影响产量和红细胞污染的因素是储存和离心温度,应保持在室温(18-25 °C)。较低的温度会增加密度梯度介质的密度,这会导致红血球和颗粒细胞污染的程度较高,因为这些细胞不会聚集。另一方面,较高的温度导致PCBC夹在聚合红细胞之间,从而降低制备15,27,28的产量。最后,在低温细胞颗粒中,液体的浓度不得超过50-100μL,这一点至关重要,因为这将对这些PBMC制剂的下游加工中获得的任何蛋白质乳酸酯的浓度产生负面影响。过量的液体会使样品过多,导致蛋白质浓度极低的利萨酸盐不适合生物标志物分析。此外,任何翻译后修改的保存都会受到损害,裂解的效率也会大大降低。
单核细胞制备管被选择,因为它们提供了最直接的方法,隔离PCBC和血浆在一次抽血的临床试验,在我们的经验,优秀的可重复性。血液处理不需要训练有素的操作员,使用单管可消除稀释血液和转移到另一管的需要,降低危险风险:由于踩刹车执行离心步骤,缩短了协议时间;并且所有试剂都在管中,这减少了变异性。根据我们的经验,与其他经典方法相比,这些好处大于这些管子的较高成本,包括仅使用密度梯度分离介质27、28(每 60 个单位 410 英镑,而淋巴素介质用于 66 50 mL 制剂是 215 英镑)。它们有两种抗凝血剂,肝素和柠檬酸盐,两种在维持分离的PCBMC35的功能方面都是可比的,因此,选择一种抗凝剂而不是另一种抗凝剂将基于肝素或柠檬酸盐在下游生物标志物研究中的可能影响。虽然已经表明,与肝素或柠檬酸盐13相比,EDTA管提供最高的PBMC隔离产量,但单管操作的易用性抵消了这一考虑。如果细胞因子要分析抗凝血剂可以有血浆检测到的水平的影响,因此这两种抗凝剂应测试之前,选择一个临床试验36。如果血浆要用于代谢学研究,使用肝素作为抗凝血剂将是首选37。因此,留给最终用户或临床试验转化科学家的唯一一点是,一旦评估成本,柠檬酸盐或肝素是否更适合其用途。
虽然使用细胞制备管的好处是多种多方面的,但与它们带来的限制(高成本和有限范围抗凝剂的可用性)相比,使用PBMC或血浆在临床试验中获取PD生物标志物的主要限制可能与隔离方法无关。除了血液癌,其中肿瘤直接从外周血液采样,其他癌症适应症血浆和PBMC是代孕组织,不一定模仿原发性肿瘤。外周组织可能不与原发性肿瘤共享基因组和表观基因组,因此,依赖特定肿瘤突变的生物标志物的外围分析主要限于ctDNA分析(来自血浆)或CTC(通过随后对PBMC层进行排序)。此外,信号级联驱动或促成肿瘤增殖可能不如活跃在外周血液中。这一挑战可以通过应用生物标志物发现方法瞄准血液8 来识别替代生物标志物或耦合前体内治疗分离血浆38 和PBMC制剂26来克服。
在目前的协议中,冷冻PBMC颗粒可以很容易地在临床部位外加工,以提供蛋白质解体,这些蛋白化解可以通过西方印迹或ELISA技术进行评估。还提出了使用 PBMC 启用 IHC 方法的替代方法(补充文件)。此外,我们还详细介绍了低温保存PBMC(见补充文件)用于免疫细胞监测的可能性,这是肿瘤学的相关应用,免疫检查点抑制剂和ADC越来越多地在临床试验中测试。评估免疫功能,如ADCC16和免疫异种化是与从单核细胞制备管15分离的冷冻保存的PBMC兼容的应用程序。低温保存有一个警告,因为它可以促进某些表面和内部标记的向下调节,并可能损害某些细胞功能,但PBMC低温保存是唯一可行的方法来执行这些检测由于时间限制时,处理样品从多个临床地点到外部实验室14,15处理,这些有害影响可以大大克服良好的解冻方法和休息期39。
总之,这里提供的协议将允许任何临床机构使用通用设备和材料可靠地制备PBMC和血浆样本,以便在全球临床试验中有力地启用来自外周血液的转化端点。
最后,我们演示了PBMC赖素的分析如何通过显示关键DDR因子的剂量依赖性转化后修饰,以机械方式告知对DNA损伤剂的反应,这可用于帮助塑造临床发展。前瞻性地实施比西方印迹(例如质谱40)更定量的方法,并且需要较少的输入材料(如毛细管西印和ELISA),将有助于将这些前结核结果转向对PBMC患者样本进行更有力、更系统的评估。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢阿斯利康肿瘤学研究和早期开发部的转化医学所有成员对协议的反馈,特别是赫德利·卡尔、塔米·叶和内森·斯坦迪弗分别就ctDNA分析的血浆制备、PBMC隔离和PBMC低温保存和免疫异种平提供建议。
1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |