OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية ، والبروتينات الطبيعية متعددة المجالات لديها بنية موحدة مع عدد وتسيطر عليها بشكل جيد ونوع من النطاقات الفرعية^1. هذه الميزة عادة ما يؤدي إلى تحسين الوظيفة البيولوجية والاستقرار^2،3. وقد تم تطوير العديد من النهج، مثل السيستين المستندة إلى اقتران السندات ثنائي كبريتيد وتكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، لبناء مثل هذا البروتين المبلمرة مع مجالات متعددة^4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن الطريقة الأولى تؤدي دائمًا إلى تسلسل عشوائي وغير منضبط ، والأخيرة تؤدي إلى مشاكل أخرى ، بما في ذلك صعوبة التعبير المفرط للبروتينات السامة والكبيرة الحجم وتنقية البروتين المعقد مع العامل المساعد والإنزيمات الحساسة الأخرى.

لمواجهة هذا التحدي، ونحن تطوير طريقة الأنزيمية التي تترافق مونومر البروتين معا للبوليمر / البروتين المتعدد بطريقة تدريجية باستخدام بروتين ليغاز OaAEP1 جنبا إلى جنب مع TEV البروتياز^8،9. OaAEP1 هو endopeptidase صارمة وفعالة. يمكن ربط بروتينين covalently كما Asn-Gly-Leu تسلسل (NGL) من خلال اثنين من التالتيني من قبل OaAEP1 في أقل من 30 دقيقة إذا كان N-terminus هو بقايا جلي ليو (GL) والآخر منها C-terminus هو مخلفات NGL¹⁰. ومع ذلك ، فإن استخدام OaAEP1 فقط لربط مونومر البروتين يؤدي إلى بروتين البوليمر مع تسلسل غير المنضبط مثل طريقة الاقتران القائمة على السيستين. لذلك ، نقوم بتصميم N-terminus لوحدة البروتين مع موقع بروتياز TEV قابل للإزالة بالإضافة إلى بقايا الليسين كـ ENLYFQ/G-L-POI. قبل انشقاق TEV، لن تشارك محطة N في ربط OaAEP1. ومن ثم يتم كشف بقايا GL في N-terminus ، والتي تتوافق مع ربط OaAEP1 ، بعد انشقاق TEV. وهكذا، حققنا طريقة التركيب الحيوي الأنزيمي متتابعة من البروتين المتعدد مع تسلسل تسيطر عليها بشكل جيد نسبيا.

هنا ، يمكن استخدام طريقة التوليف الأنزيمية خطوة بخطوة في إعداد عينة البروتين ، بما في ذلك تسلسل تسيطر عليها وغير المنضبط ، وتجميد البروتين للدراسات جزيء واحد كذلك ، وخاصة بالنسبة للنظام المعقد مثل metalloprotein.

وعلاوة على ذلك، تسمح لنا تجارب SMFS المستندة إلى AFM بتأكيد بناء البوليمر البروتيني واستقراره على مستوى الجزيء الواحد. الفئاب الطيفي أحادية الجزيء، بما في ذلك AFM، ملاقط بصرية وملاقط مغناطيسي، هو أداة عامة في تكنولوجيا النانو للتلاعب بالجزيء الحيوي ميكانيكيا وقياس استقرارها^{11،12،13،14،15،16،17،18،19،20.} وقد استخدمت على نطاق واسع AFM جزيء واحد في دراسة البروتين (الأمم المتحدة) قابلة للطي^21،22،23،24^،25، وقياس قوة مستقبلات ليغاند التفاعل^{26،27،28،29،30،31،32،33،}34 ،^{34، 35}، السندات الكيميائية غير العضوية^{20،36،37،38،39،40،41،}42^،43والمعادن ligand السندات في metalloprotein^{44،45،46،47،48،49، 50} . هنا، يتم استخدام AFM جزيء واحد للتحقق من تسلسل البروتين متعدد البروتين توليفها على أساس إشارة البروتين تتكشف المقابلة.