蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

1. アルキン蛍光ホールの合成 NBD-アルキエンの合成(7-ニトロ-N-(prop-2-yn-1-yl)ベンゾ[c[1,2,5]オキサジアゾール-4-アミン) テトラヒドロフラン(THF)の60 mLに4-クロロ-7-ニトロベンゾフラン(5.181 mmol)の1,031 mgを溶解します。1,857 mg の CsCO3 (5.696 mmol) を加え、その後 0.39 mL のプロパルギルラミン (6.1 mmol) を加えます。反応を50°Cに加熱し、茶色から緑に変わり、室温(RT)に冷却します。 フィルター処理補助(材料表を参照)を使用して反応をフィルタリングし、酢酸エチル(EA)で洗浄します。減圧下で濾液を濃縮し、残渣を150mLのEAに溶解し、500mLの分離漏斗に移動します。 EA溶液を水とブラインでそれぞれ100mLで洗浄します。その後、水相を組み合わせて、EAの100 mLで2倍洗浄します。 無水硫酸マグネシウムの上に結合された有機相を乾燥させ、次いで減圧下で濾過し、濃縮する。 シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル[PE]の20~30)による粗精製、液体クロマトグラフィー質量分析法(LCMS、M+H+=219.1)、核磁気共鳴(NMR)分光法による純度チェック、化学シフト:以下のとおり:1H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 5.7 Hz, J = 2.5 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 2.5 Hz, 1H); 13C NMR(CD3OD、150 MHz)δ 144.3、143.7、142.2、135.8、125.7、100.0、76.5、74.2、33.4。注:シリカゲルクロマトグラフィーによる精製を行う場合は、記載されている溶媒の極性を低くしてカラムを準備してください。粗化合物は、溶解性がそれを許さない場合は、濃縮溶液としてロードされるか、またはシリカに吸着され得る。化合物をシリカの上部に添加した後、シリカ湿潤に使用したのと同じ溶媒の1~2カラムの体積を通して実行します。次に、記載されている溶媒比から始め、各溶媒の少なくとも1カラム体積を通して走り、溶媒組成に大きなジャンプをしないようにする。分数を収集し、LCMSまたはTLC(薄層クロマトグラフィー)によって純度/同一性を確認します。純粋な分画を組み合わせ、ロータリー蒸発によって減圧下で濃縮します。 DMACA-アルキンの合成 (2-(7-(ジメチルアミノ)-2-オキソ-2H-クロム-4-yl)-N-(プロップ-2-yn-1-yl)アセトアミド。3-(ジメチルアミノ)フェノール(36.6 mmol)の5.02gを30mLのエタノールに溶解し、6.7 mLのジエチル1,3-アセトネジカルボキシル酸(36mmol)を加えます。ZnCl2 (77.2 mmol) の 10.5 g を加え、赤の溶液を 42 時間還流します。 反応を冷却し、減圧下で濃縮します。得られた赤い固体をEAの200mLに分散させ、フィルターし、次いで500mL分離漏斗に移します。 EAを水と塩水でそれぞれ200mLで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させます。乾燥した有機相をろ過し、減圧下で濃縮します。 シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー(PEで0~100)、LCMS([M+H]+=275.1)および/またはNMRによる純度をチェックすることにより、赤い固体(エチル2-(7-(ジメチルアミノ)-2-オキソ-2-クロム-4-yl)酢酸)を精製し、純度をLCMS([M+H]+=275.1)および/またはNMRで確認します。1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ 7.30 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 8.9 Hz, J = 2.6 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 5.87 (m, 1H), 2.96 (m, 8H), 2.25 (d, J = 1.2 Hz, 3H). 488 mg の エチル 2-(ジメチルアミノ)-2-oxo-2H-クロム酸-4-yl)酢酸 (1.18 mmol) を THF の 10 mL に溶解し、157 mg の LiOH を加え水の15 mLのH2O(3.74 mmol)。RTで3時間反応をかき混ぜ、分離漏斗に移動し、さらに50mLの水で希釈します。 50 mLのジエチルエーテル(Et2O)で反応混合物2xを洗浄し、25mLの水で複合有機相2xを洗浄します。有機層で黄色の沈殿物を取ります。ロータリーエバポレーターを使用して、減圧下で有機相を濃縮します。 水相を濃縮HClでpH=2に酸性化し、一晩4°Cまで冷却した。酸性化水相をろ過し、濃有機相に黄色の固体を加えます。注:2-(ジメチルアミノ)-2-oxo-2-oxo-4-yl)酢酸は、それ以上の精製なしで使用することができますが、これはLCMS([M+H]+=247.1)および/またはNMR、化学シフト、次のようにチェックすることができます。1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9.0 Hz, 1H ) 6.62 (dd, J = 9.2 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.98 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H), 2.35 (s, 0.9 Hz, 2H); 13C NMR(CDCl 3、150 MHz)δ 162.2、155.7、152.9、152.8、125.3、109.7、109.3、109.1、108.8、98.3、40.2、18.5。 466 mg の 2-(ジメチルアミノ)-2-oxo-2H-クロム酸-4-yl)酢酸 (1.89 ミリモル) を乾燥Nの 7 mL に溶解します。 窒素下の乾燥DMFの7 mLにプロピルラミン(5.1 mmol)を0.33 mL溶かします。色素溶液に1.30 mLのジイソプロピルエチルアミン(DIPEA,7.50 mmol)を加え、535 mg のO-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-yl)-1,1,3,3,3-テトラメチルロニウム六フッ素リン酸(HCTU,1.29mmol)を加えた。活性化染料溶液をRTで15分間かき混ぜ、アミン溶液を滴下し、一晩かき混ぜます。 翌日、35 mLの水で反応を薄め、減圧下で濃縮します。 得られたオレンジ色の固体をEAとブライン(それぞれ100 mL)の間に250 mLの分ける漏斗に分ける。層を分離し(2つの層を異なるフラスコに実行)、100mLのEAで水相を洗浄します。 複合有機相を減圧下に濃縮し、オレンジ色の固体を1:1アセトニトリル(ACN)/水(v/v)の3 mLに再溶解します。C18カートリッジカラム(溶剤A:水、溶剤B:ACN)を搭載した逆相中圧液体クロマトグラフィー(MPLC)系に注入して粗生成物を精製する。 LCMS([M+H]+=284.1、NMR化学シフト以下)による純度を確認し、適切な画分を組み合わせて凍結乾燥して2-(7-(ジメチルアミノ)-2-oxo-2H-クロム-4-yl)-N -(prop-2-yn-1-yl)アセタミド、NMR化学シフトを以下のように与える: 1H NMR (600 MHz、 DMSO-d6) δ 8.65 (t, J = 5.4Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.0Hz, 1H)、6.72(dd、J = 9.1、2.6 Hz、1H)、6.55(d、J = 2.6 Hz、1H)、6.00(s、1H)、3.88-3.87(m、2H)、3.62(s、2H)、3.13(t、J = 2.5 Hz、1H)、6.0H(1H)、6.0H(1H)、6.55 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4. 2. 蛍光性抗生物質の合成 前述の抗生物質のアジド誘導体を調製する14,15,16.注:手順は各抗生物質に固有であり、機能化された抗生物質が親と同等の活性を保持していることを確認するために、親分子の構造活性関係(SAR)を慎重に調べる必要があります。(例えば、シプロフロキサシン16、リネゾリド14、トリメトプリム15)。公開された蛍光系抗生物質の例については、図1、および一般的な合成スキームを参照してください。 クリック反応手順 A注:ほとんどの抗生物質については、銅触媒されたハウスゲン[2+3]アジドのシクロ付加(ステップ2.1)と蛍光アルキン(ステップ1で準備)についてここで詳述する手順に従ってください。 丸い底のフラスコにアジド抗生物質を入れ、tert-ブタノール(tBuOH)と水(1:1 v/v、mmolアジドあたり25 mL)を加えます。 ステップ1.1(3 eq.)で調製したフルオロフォアアルキンを加え、反応を50°Cに加熱します。次いで、硫酸銅(水で100mM、0.6 eq.)を加え、続いてアスコルビン酸(水で500mM、2.4eq.) 50°Cで1時間か、反応完了の指示に従ってLCMSによる分析まで(開始アジドの完全な消費)。 反応を冷却し、抗生物質足場に適宜精製し、ステップ2.3または2.4のいずれかによって精製に進みます。注:足場の極性と安定性に応じて、いくつかの異なる精製方法が可能です。 クリック反応手順 B注:ペプチドベースの抗生物質に対してこの手順に従い、より強い反応条件を提供します(未発表の研究、Phetsang、2019)。 丸い底フラスコにペプチドアジド抗生物質を入れ、溶解するのに十分なDMF(750 mL/mmolアジド)を加えます。 ステップ1(5 eq.)で調製したフルオロフォアアルキンを加え、反応を50°Cに1時間加熱する。 銅(I)ヨウ化物(20eq.)、次にDIPEA(120eq.)、酢酸(240 eq.)を加える。 反応を50°Cで1時間かき混ぜ、またはLCMSによる分析が反応完了を示すまで(すなわち、開始アジドの完全な消費)。反応を冷却し、方法1(ステップ2.3参照)による精製を進めます。 精製方法1(シプロフロキサシン、トリメトプリム、リネゾリドに使用) 冷却されたクリック反応を直接MPLC C18カートリッジカラムに注入します。 ランの開始時に長い洗浄段階(約10分)を組み込み(100%溶媒A)、次いで100%溶媒Bまでの勾配を実行し、続いて溶剤Aに戻す。注:水から溶剤A、水に0.05~0.1%、水に含まれる0.05~0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)から選択できます。溶媒Bはアセトニトリル(ACN)、ACNの0.05~0.1、ACNで0.05~0.1%のTFAから選択でき、溶剤Aと一致します。溶出が困難であることが判明した場合、メタノールはACNの代わりに使用され得る。 LCMSと色(正しい質量、特異なピーク)で示されるように、適切な画分を収集し、組み合わせて、凍結乾燥し、(半)純粋な蛍光抗生物質を得る。 必要に応じて、製品をさらに精製します。NMRおよび/またはLCMSおよび高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によって純度を評価し、足場に適したカラムおよび方法を使用して。 精製方法 2注:溶解性が許す場合、前処理は水性ワークアップ(マクロライド、未発表の作品、ストーン2019に使用される)によって行うことができます。 冷却されたクリック反応を水とEt2O(1:1 v/v、初期反応量から約10倍の希釈)で希釈し、適切な大きさの分離漏斗に移す。 層を分離し、Et2 Oで水相を2回洗浄します。 結合された有機相を水(有機相と等しい体積)で2x洗浄し、Na2SO4で乾燥させます。 乾燥した有機相をろ過し、減圧下で濃縮します。 MPLCおよび/またはHPLCによって粗生成物を精製します(ステップ2.4.4で説明したとおり)。注: 不完全、完全、および精製されたクリック反応 LCMS トレースの例については、図 2を参照してください。抗生物質-フルオロフォアクリック反応の典型的な精製収率は30~80%の範囲です。注意:これらの合成物で使用される化学物質のほとんどは、特定の安全上の危険を有します。個人保護具の使用を含め、常時注意が必要です。Et2O, tBuOH, FA, 酢酸, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, プロパルギラミン, HCTU はすべて可燃性です;熱や火花源との接触を避けてください。THF, プロパルギラミン, DIPEA, tBuOH, FA, DMF, PE はすべて有毒です;露出を避ける。プロパルギラミン、 CsCO3、 ZnCl2、 LiOH-H2O 、 DIPEA、 CuI、 FA 、酢酸、および HCl はすべて腐食性です。接触を避け、表面接触に注意してください。ZnCl2、 CuSO4、 CuI 、および PE は環境の危険を提示します。廃棄条件に注意してください。THFは爆発性過酸化物を形成することができる;保管条件に注意してください。有機アジドは爆発性です。特に大規模生産に注意してください。 3. 抗菌活性の評価 注:細菌に関するすべての作業は、アッセイまたは実験室の汚染を避けるために無菌条件下で行われるべきです。すべての媒体は使用前にオートクレーブされ、プラスチック製品やピペットなどの機器は無菌にしておく必要があります。バイオ封じ込めフード(タイプ2)で作業することをお勧めします。 抗生物質足場に適した細菌株のストリークグリセロールストックをリソゲニースープ寒天(LB、メーカーの指示に従って調製)にし、37°Cで一晩成長する。注:抗菌活性をテストする細菌の選択は、使用されている抗生物質足場に基づいて行われなければなりません。抗生物質の影響を受けやすいことがわかっている種から5~10個の細菌の代表範囲を選択し、ラボの物流能力を考慮する必要があります。可能であれば、耐性菌も検査する必要があります。以下のプロトコルは、ほとんどの細菌で動作しますが、特別な条件(例えば、CO2、特殊媒体)が必要かどうかを確認し、必要に応じて変更を加えます。これらの条件を用いて正常にアッセイされた細菌には、ブドウ球菌、連鎖球菌、バチル菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、およびエンテロコッカス・フェシウムが挙げられる。 プレートから単一コロニーを選び、37°Cで5 mLのカチオン調整ミューラー・ヒントンブロス(CAMHB、メーカーの指示に従って調製)で一晩培養します。 CAMHBで一晩培養を40倍に希釈し、600 nm(OD 600)=0.4~0.8、体積5mLで中ログ相の光密度まで成長します。 滅菌水中の1.28mg/mLで各蛍光抗生物質のストック溶液を調製し、96ウェルプレートの最初のカラムに10μLの抗生物質をピペット状に調製します。 最初のカラムに90 μLのCAMHBを加え、他のすべてのウェルに50 μLを加えます。次いで、プレートを横切って連続2倍希釈を行う。 完全に混合し、その後、〜106コロニー形成ユニット(CFU)/mLに中間相培養を希釈し、すべての井戸に50 μLを加え、〜5 x 105 CFU /mLの最終濃度を提供します。カルチャのボリューム(mL) = (mL のメディアボリューム)/(OD600 x 1,000)例えば、12 mL の所望の媒体容積で OD600 = 0.5 カルチャの場合、(12/(0.5 x 1,000) = 12 mL の培地に対して 0.024 mL の培養を追加します。 プレートを蓋で覆い、37 °Cで18~24時間、揺らせずにインキュベートします。 MICが目に見える成長のない最も低い濃度であるプレートを視覚的に検査します。注:活性および非アクティブ蛍光抗生物質の例については表1を参照してください。 4. 分光光測定とフローサイトメトリーによるプローブ蓄積解析 注:これらの遠心時間は大腸菌用に最適化されているので、他の種にはわずかな変更が必要な場合があります。NBD標識シプロフロキサシンプローブに対するプローブ蓄積の代表データが報告されています。 LB寒天上の細菌株のストリークグリセロール株と37°Cで一晩成長します。 プレートから単一コロニーを選び、37°CでLBで一晩培養する。 一晩培養を培地で50倍に希釈し、中ログ相(OD600 = 0.4~0.8)まで成長させる。 文化を1,470 x gで25分間遠心分離し、メディアをデカントします。 1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細菌を再懸濁し、1,470 x gで15分間遠心分離します。 培地をデカントし、洗浄したペレットをPBS中で最終OD600=2に再懸濁する。 必要に応じて、10.1 μLのカルボニルシアン化3-クロロフェニルヒドラゾン(PBSで10 mM)を1mLの細菌(最終濃度100μM)に加え、37°Cで10分間インキュベートします。注:CCCPはエフラックスポンプ阻害剤です。CCCPを添加すると、流出の影響を調べる。 20°Cで4分間18,000 x gで培養物を遠心分離し、メディアをデカントします。 1 mLの蛍光抗生物質溶液(PBSで10~100μM)をペレットに加え、37°Cで30分間インキュベートします。 4°Cで7分間18,000 x gで培養物を遠心分離し、メディアをデカントします。 1 mLの冷たいPBSで細菌を再懸濁し、ステップ4.9を繰り返す。 手順 4.10 を合計 4 倍繰り返します。 必要に応じて、180 μLのリシスバッファー(20 mM Tris-HCl、pH 8.0、および2 mMナトリウムEDTA)を加えて、リゾチーム(H2O中72mg/mL)の70μLを加えて、細菌をリゼします。 37°Cで30分間インキュベートし、3xを凍結解凍します(-78 °Cは5分、34°Cは15分です)。 サンプルを20分間超音波処理し、30分間65°Cまで加熱します。 中に、18,000 x g、8分のサンプルを遠心分離し、10 kDa フィルター膜をフィルターします。 フィルターを4xに100μLの水で洗います。 ライセートをフラットボトムブラック96ウェルプレートに移し、蛍光色素に適した励起波長と発光波長を有するプレートリーダー上の蛍光強度を測定する(すなわち、DMACA:λex = 400 nm、λem = 490 nm;NBD: λex = 475 nm, λem = 545 nm)。注:蛍光NBD標識シプロフロキサシン系抗生物質を用いた細菌の分光光分析の例については、図3を参照してください。 フローサイトメトリーによる分析では、同じ成長条件と染色条件(ステップ4.1~4.17)を使用し、最終調製時にのみ変更を加えます。 合計ボリュームを PBS の 1 mL にします。 データ取得用の対数増幅を使用して、約60 μL/分の流量でフローサイトメーター上のサンプルを読み取ります(F1励起 = 488 nm; 放出 = 525/20 nm)。 合計 10,000 件のイベントを記録し、適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。 F1からの蛍光強度を事象数数に対してプロットし、細菌が染色された後のヒストグラムピークからの蛍光強度の中央値を推定する。注: NBD標識シプロフロキサシン系抗生物質を用いた細菌のフローサイトメトリー分析の例については、図4を参照してください。 5. 顕微鏡分析の準備 MIC評価の場合は、サブカルチャーをOD600 = 0.4に成長させ、3~5分で18,000 x gで1mLのアリコートと遠心分離に分割します。 デカントと廃棄メディアを、その後、HBSSの500 μLで細菌ペレットを再懸濁します。 18,000 x gで3分間遠心分離し、メディアをデカントして廃棄します。 HBSSの抗生物質プローブの溶液を1~100μMの濃度で調製します。 洗浄した細菌をプローブ溶液の500μLで再懸濁し、37°Cで30分間インキュベートする。 手順 5.3 を繰り返します。多重標識実験の場合、ペレットを直交色付き核酸色素の500μLに再懸濁します。グリーンの場合は、Syto9(HBSSで5 μM)を使用します。青の場合は、HOEchst 33342(HBSSでは20 μg/mL)を使用します。RTで15〜30分間インキュベートします。 ステップ5.3を繰り返し、FM4-64FX(HBSSで5μg/mL)の500 μLで再サスペンドし、RTで5分間インキュベートします。 ステップ5.3を繰り返し、500 μLのHBSSで再サスペンドし、ステップ5.3をもう一度繰り返します。 ステップ5.8を繰り返し、最後に洗浄した染色された細菌を15μLの取り付け媒体でサスペンドします(材料表を参照)。 顕微鏡のスライドおよび高性能カバースリップと上にピペット取り付け媒体、次に明確なマニキュアで端を密封する。注: NBD標識シプロフロキサシンおよびトリメトプリム系抗生物質で撮影された共焦点顕微鏡画像の例については図5を、DMACA標識オキサゾリジオン(リネゾリド)抗生物質の場合は図6を参照してください。