Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Alle werkzaamheden waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Comité voor institutionele dierenzorg en -gebruik (IACUC) van het College van William en Mary. 1. Behandeling van dierverzorging en embryo’s Induceer natuurlijke paring door het toedienen van een onderhuidse injectie van menselijke chorionische gonadotropine (HCG) in de dorsale lymfezak van volwassen Xenopus laevis bij een dosis van 600 U voor vrouwen en 400 U voor mannen. Plaats na injectie ten minste één mannelijke en één vrouwelijke kikker ‘s nachts in een kamertemperatuurtank. Het leggen van eieren begint meestal 9-12 uur na HCG administratie. Verzamel embryo’s. Dejelly door zachtjes te wassen met 2% cysteïne (pH 8.0) gedurende 2-4 min. Spoel de embryo’s 3x in 0,1x Mark’s Modified Ringer’s solution (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH aangepast aan 7,4-7,6). Breng de embryo’s over naar 100 mm glazen petrischaaltjes met 0,1x MMR en 50 μg/mL gentamycine. Een dichtheid van 50-100 embryo’s per plaat is geschikt. Bebroed de gerechten bij 14 °C–22°C en laat de embryo’s zich ontwikkelen tot ze de gewenste ontwikkelingsfase(en) bereiken. Verwijder periodiek onbevruchte cellen en necrotische of abnormaal ontwikkelende embryo’s met een plastic overdrachtspipet.OPMERKING: Om consistentie te garanderen, wordt ontwikkelingsfasefase uitgevoerd volgens morfologische criteria gedefinieerd door Nieuwkoop en Faber16. Stadia van belang zullen variëren op basis van experimentele focus. Zo worden belangrijke neuroontwikkelingsoriëntatiepunten geassocieerd met fase 14 (begin van neurculatie), fase 18 (begin van neurale buissluiting) en fase 22 (begin van de verlenging van de staartknop). 2. Embryodissectie en monsterpreparaat Voorbereiding van de oplossing Bereid 2 mM Ca2+ oplossing voor met 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl2·2H2O, 1,31 mM MgSO4en 4,6 mM Tris. Voeg voor elke 100 mL-oplossing 1 mL penicilline/streptomycine (10.000 U/mL penicilline; 10.000 μg/mL streptomycine). Pas pH aan op 7,8 en filter steriliseren. Bereid calcium- en magnesiumvrije (CMF) oplossing voor door 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris en 0,4 mM EDTA te combineren. Pas pH aan op 7,8 en autoclave om te steriliseren. Voeg voor elke 100 mL-oplossing 1 mL penicilline/streptomycine (10.000 U/mL penicilline; 10.000 μg/mL streptomycine). Pas pH aan op 7,8 en filter steriliseren. Bereiding van platen voor dissectie en beeldvorming UV-steriliseren twee 35 mm plastic petrischaaltjes en een 35 mm Cell Culture Dish (zie Tafel van Materialen). Tijdens het werken in een laminaire flow hood, bereid twee 50 mL plastic conische buizen met 10 mL van 2 mM Ca2 + oplossing elk. Blijf werken in de laminaire flow hood en voeg 2 mL van 2 mM Ca2 + oplossing toe aan een 35 mm plastic petrischaal, 2 mL van 2 mM Ca2+ oplossing voor één 35 mm Cell Culture Dish en 2 mL CMF-oplossing aan één 35 mm plastic petrischaal. Buiten de laminaire stroomkap vul je twee 100 mm plastic petrischalen en een 35 mm plastic petrischaal met 0,1x MMR met gentamycine (50 μg/mL). Vul een 60 mm plastic petrischaal met 70% ethanol. Voeg vlak voor de dissectie 0,01 g Collagenase B toe aan een van de 50 mL buizen met Ca2+ oplossing. Meng goed en breng de oplossing over op een verse 60 mm plastic petrischaal. Identificeer met behulp van een ontledende microscoop embryo’s van de gewenste ontwikkelingsfase. Gebruik een steriele overdrachtspipet om ten minste zes geschikte embryo’s over te brengen naar een van de 100 mm platen met 0,1 x MMR + gentamycine bereid in stap 2.2.4. Dit zal dienen als de holding plaat. Gebruik een steriele overdrachtspipet om één embryo over te brengen op de tweede 100 mm plaat met 0,1x MMR + gentamycine. Dit zal dienen als de dissectie plaat. Als het ontleden van embryo’s oud genoeg om te bewegen (ongeveer fase 23 of ouder), verdoven elk embryo voorafgaand aan de dissectie door het over te brengen naar een schotel met 0,1% 3-aminobenzoëzuur ethylester verdund in 0,1x MMR met gentamycine (50 μg/mL). Zodra het embryo is geïmmobiliseerd, breng het terug naar de schotel met 0,1x MMR met gentamycine (50 μg/mL) en ga verder met de dissectie. Verwijder voorzichtig het vitellinemembraan dat het embryo omringt. Dit kan het gemakkelijkst worden gedaan met behulp van een paar stompe tangen om het embryo te stabiliseren tijdens het gebruik van een paar fijne tangen om het membraan te grijpen. Trek voorzichtig met de fijne tangen om het vitellinemembraan uit elkaar te pellen. Gebruik fijne tangen om de rug- en ventrale gebieden van het embryo te scheiden. Dit kan worden gedaan door het gebruik van de tangen te ‘knijpen’ het embryo langs de voorste-achterste as, snijden in de helft. Breng met een steriele overdrachtspipet het ruggedeelte over op de 60 mm plaat met collageenoplossing bereid in stap 2.2.5. Gooi het ventrale gedeelte weg. Laat de dorsale explant 1-2 min bij kamertemperatuur inde collageenoplossing uitbroeden. Breng het voorzichtig terug naar de dissectieplaat. Voltooi de dissectie door zorgvuldig alle resterende endodermale en mesodermale verontreiniging uit het vermoedelijke neurale weefsel van het ectoderm zorgvuldig te verwijderen. Voor embryo’s in fase 22 of ouder moet de neurale buis ook worden verwijderd en weggegooid.OPMERKING: Indien nodig tijdens de dissectie, kan het gerecht van 70% ethanol bereid in stap 2.2.4 worden gebruikt om de tangen te wissen of opnieuw te steriliseren. Zodra de dissectie is voltooid, breng voorzichtig de explant naar de 35 mm plaat van Ca2 + oplossing bereid in stap 2.2.3. Herhaal stap 2.4-2.9 tot vier explants zijn verzameld. Gebruik een P1000 micropipet om alle vier de explants over te brengen naar de 35 mm plaat met CMF-oplossing, waarbij u ervoor zorgt dat elk contact tussen de explants en de luchtwaterinterface wordt vermeden. Draai de schotel voorzichtig zodat alle explants in het midden van de plaat clusteren. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur om explants te laten scheiden.OPMERKING: Om te helpen bij de dissociatie, 0,025%–0,01% trypsine kan worden toegevoegd aan de CMF-oplossing. Dit kan nodig zijn voor een efficiënte dissociatie van oudere embryo’s (fase 22 en ouder). Op dit punt moeten ten minste twee op de juiste plaats geënsceneerde embryo’s op de bedrijfsplaat blijven staan. Breng deze embryo’s over naar een vers gerecht gevuld met 0,1x MMR met gentamycine bereid in stap 2.2.4 en laat ze zich ongestoord ontwikkelen met het gerecht dat bedekt is om de explantschotel te evenaren. Deze embryo’s zullen dienen als broer of zus controles. Gebruik superlijm om een micro-geregeerde coverslip (zie Tabel met materialen)aan de onderkant van de 35 mm Cell Culture Dish bereid in stap 2.2.3 te bevestigen.LET OP: Plaats kleine schar van superlijm rond de randen van de coverslip, druk het stevig tegen de onderkant van de Cell Culture Dish. De positionele markeringen worden overal verduisterd dat de lijm het rooster bereikt, dus het is belangrijk om het centrale gerasterde gedeelte van de coverslip vrij te houden van lijm. Nadat de explants hebben gescheiden voor 1 uur, gebruik maken van een P100 micropipet om ze over te dragen aan de Cell Culture Dish. Om zoveel mogelijk cellen op het gerasterde gedeelte van de schotel te plaatsen, houdt u de pipet in een ondiepe hoek dicht bij het oppervlak van de schotel, plaatst u de pipetpunt in de hoek van het rooster naar binnen gericht en verwijdert u de celvering stevig over de gerasterde ar ea. Idealiter zullen cellen zich vestigen in een strak dicht cluster. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om cellen aan de plaat te laten hechten. Bepaal en leg de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo’s wanneer deze incubatie begint. Combineer 5 μL 1 mM Fluo-4 AM (zie Tabel met materialen) met 2 μL van 10% Pluronic F-127 zuur.OPMERKING: Fluo-4 AM is lichtgevoelig en moet te allen tijde in een lichtveilige of met folie bedekte buis worden bewaard. Nadat de incubatie tijd is voltooid, verplaatst u de monsterschaal naar een donkere kamer of een andere lichtbeveiligde locatie. Gebruik een micropipetom om 100 μL oplossing van de rand van de schotel te verwijderen. Voeg deze oplossing toe aan de aliquot van Fluo-4 AM/Pluronic F-127 zuur, pipet op en neer om te mengen, en breng het volledige volume terug naar de monsterschotel. Draai zachtjes om te mengen. Bedek de plaat met aluminiumfolie en laat 1 uur bij kamertemperatuur uitbroeden. Bepaal en leg de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo’s wanneer deze incubatie begint. Aan het einde van de incubatie, gebruik maken van de resterende conische buis van 2 mM Ca2 + om drie media wasbeurten uit te voeren op de volgende manier: 1) verwijder 1 mL oplossing uit de schotel, voeg 3 mL verse oplossing, voeg 3 mL van verse oplossing. 3. Calciumbeeldvorming OPMERKING: Calcium beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een omgekeerde confocale microscoop(Tabel van materialen). Plaats de monsterplaat op het microscoopstadium en zorg ervoor dat deze wordt beschermd tegen blootstelling aan omgevingslicht. Zodra de plaat is bevestigd, gebruik een marker om het voorste punt van de plaat te etiketteren, zodat hetzelfde gezichtsveld kan worden gevonden in de volgende beeldvorming. Zoek het monster onder de microscoop – eerst op 10X en vervolgens bij 20X vergroting – en selecteer een geschikt gezichtsveld voor beeldvorming. Een ideaal gezichtsveld is celdicht, maar niet zo dicht dat cellen worden samengeklonterd of moeilijk individueel te onderscheiden. Pas de microscoopfocus aan zodat de door het raster geregeerde coverslip zichtbaar is. De nummers die op de coverslip zijn gemarkeerd, dienen als unieke id’s voor bepaalde rasterlocus en kunnen worden gebruikt om hetzelfde gezichtsveld te vinden voor aanvullende beeldvorming. Als het oorspronkelijk geselecteerde gezichtsveld niet overlapt met getallen, wordt u pas geselecteerd totdat een identificeerbaar getal in beeld is. Neem een helder veldbeeld van het geselecteerde gezichtsveld met de door het raster geregeerde coverslip scherp. Pas de focusinstellingen aan en maak een helder veldbeeld van het geselecteerde gezichtsveld met de cellen scherp. Met de cellaag in focus, verlicht de monsters met een 488 nm laser. HV- en Offsetwaarden kunnen voor elk experiment worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat een dynamisch bereik van fluorescentie wordt gedetecteerd op het FITC-kanaal. Wijzig voor een afbeelding van twee uur de beeldconfiguratie om 901 frames op te nemen met een scantijd van 3,93 s en een interval van 8 s. Voer de configuratie uit om een afbeelding te verkrijgen. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwijder de plaat uit de microscoop fase. Verwijder 1 mL oplossing van de plaat en vervang deze door 1 mL van 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA en 2 mM MgSO4 in 7,4% formaldehyde). Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of ‘s nachts bij 4 °C. Bepaal en leg de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo’s wanneer deze incubatie begint. Nadat de fixatie is voltooid, verwijder alle oplossing van de plaat en vervang deze door 2 mL 1x PBS. Bewaar platen bij 4 °C voor verdere verwerking. 4. Gen expressie analyse: Sonde Synthese Zoals hieronder beschreven, het genereren van een antisense RNA sonde voor in situ hybridisatie. Bovendien, het genereren van een sense probe voor hetzelfde gen voor gebruik als een negatieve controle. Om plasmidDNA te zuiveren dat de sondesjabloonopeenvolging bevat, inent 150 mL van bouillon VAN LB met bacteriële glycerolvoorraden die de malplaatjeplasmid bevatten. Incubeer bij 37 °C met schudden ‘s nachts of tot de cultuur troebel is. Zuiver plasmide DNA uit de bacteriële cultuur met behulp van uw methode van keuze.LET OP: We gebruiken de McNary-Nagel midi-prep kit om hoge opbrengsten plasmid DNA te verkrijgen. Om te bevestigen dat de plasmid de verwachte insert bevat, voert u een beperkingsvertuiting uit en analyseert u de producten op een agarosegel. Onbesneden plasmid kan ook worden geanalyseerd op een agarose gel om te controleren op genomische DNA-besmetting. Om het sjabloon-DNA te lineariseren, stelt u een 100 μL-beperkingsvergisterreactie in die 20 μg plasedisch DNA, 2 μL van het juiste beperkingsenzym en 1x geschikte buffer bevat. Incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur. Extract gelineariseerd DNA door het uitvoeren van een fenol / chloroform extractie gevolgd door een chloroform extractie. Neerslag DNA met 100% ethanol. Dit kan snel worden gedaan door het toevoegen van twee volumes koude ethanol aan het monster en het uitbroeden op -80 °C totdat het stolt (15-30 min). Gebruik een gekoelde centrifuge om DNA te pelletren door 20 min te spinnen bij 12.000 x g/4 °C. Verwijder de supernatant en was de pellet met 200 μL van 70% ethanol. Draai gedurende 5 min bij 12.000 x g/4 °C. Verwijder de supernatant en luchtdroge pellet gedurende ongeveer 5 min. Resuspend in 20 μL van 1x TE en bewaar bij 4 °C tot verder gebruik. Om antisense RNA-sonde te synthetiseren en te zuiveren, maakt u een rNTP-mix van 2,5 mM m m door 15 μL van 10 mM rCTP, 15 μL van 10 mM rATP, 9,75 μL van 10 mM rUTP en 5,25 μL van 10 mM dig-11 UTP (Zie Tabel met materialen). Een 50 μL in vitro transcriptiereactie instellen die 4 μg gelineariseerd sjabloon-DNA bevat vanaf stap 4.2-4.10; 15 μL van 2,5 mM rNTP-mix uit stap 4.11, 10 μL van 5x transcriptiebuffer, 5 μL van 0,1 M DTT, 0,5 μL RNAse-remmer (20 U/μL) en 1,5 μL geschikte RNA polymerase (T3, T7 of SP6). Incubeer 1 uur bij 37 °C. Voeg een extra 1,5 μL RNA polymerase toe aan de reactie en keer gedurende een uur terug naar 37 °C. Voeg 1 μL RQ1 DNAse toe aan de reactie en incubeer bij 37 °C gedurende 10 min om de DNA-sjabloon te degraderen. Voeg 30 μL van 7,5 M LiCl-oplossing toe aan monster. Pipette om te mengen en uitte broeden op -20 °C gedurende ten minste 1 uur. Draai het monster met behulp van een gekoelde centrifuge 25 min bij 14.000 x g/4 °C. Verwijder de supernatant en spoel de pellet af met 500 μL van 70% ethanol. Draai 5 min bij 14.000 x g/4 °C. Verwijder de supernatant en luchtdroogpellet gedurende ongeveer 5 min. Resuspend in 20 μL nuclease-vrij water. Maak op 10x sondevoorraad door het monster te verdunnen tot een concentratie van 10 ng/μL in hybridisatiebuffer (50% formamide; 5x SSC (zout-natriumcitraat; 750 mM NaCl, 75 mM natriumcitraat, pH 7.0), 1 mg/mL torula RNA, 0,1 % Tween-20, 1x Denhardt’s Solution, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA en 100 μg/mL heparine). Bewaar bij -20 °C tot verder gebruik. 5. Genexpressie Analyse: Fluorescentie In Situ Hybridization OPMERKING: Alle wasbeurten moeten worden uitgevoerd met ongeveer 1 mL oplossing met behulp van een steriele, individueel verpakte overdracht pipet. De pipet moet bij het verwijderen of toevoegen van de oplossing aan de rand van de plaat worden geplaatst en wasbeurten moeten zo voorzichtig mogelijk worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat cellen niet van het plaatoppervlak worden losgemaakt en verloren gaan. Verwijder 1x PBS van plaat (vanaf stap 3.10). Vervang door verse 1x PBS en incubeer 5 min bij kamertemperatuur. Combineer 25 mL van 0,1 M triethanolamine (pH 8.0) met 62,5 μL azijnzuuranhydride. Meng goed. Was de plaat met deze oplossing voor 10 min. Was de plaat met 1x SSC gedurende 5 min. Was de plaat met 0,02 M HCl gedurende 10 min om cellen te doorsijpelen. Was 2x met 1x PBS voor 5 min per stuk. Verwijder de oplossing en voeg 1 mL hybridisatiebuffer (50% formamide, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitraat, pH 7.0), 1 mg/mL torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x Denhardt’s Solution, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA en 100 μg/mL heparin) op plaat. Incubeer met schudden voor ten minste 6 uur bij 60 °C. Verwijder hybridisatiebuffer en vervang deze door 750 μL 1x RNA Probe-oplossing (verdund vorm de 10x-voorraad in stap 4.19. Sense RNA sondes kunnen worden gebruikt als een negatieve controle. Incubeer met schudden voor 8-14 uur bij 60 °C. Verwijder de sonde en bewaar bij -20 °C.LET OP: 1x sondeverdunning kan tot drie keer worden hergebruikt voordat deze wordt weggegooid. Spoel de plaat af met 0,2x SSC. Was met verse 0,2x SSC gedurende 1 uur bij 60 °C. Verplaats de platen naar kamertemperatuur en equilibrate gedurende 5 min. Was de plaat met 0,2x SSC gedurende 5 min. Was de plaat met 1x PBT gedurende 15 min. Was de plaat met 2% H2O2 in 1x PBT (0,1% Triton-x-100) gedurende 1 uur.OPMERKING: Deze oplossing is lichtgevoelig, dus het moet vers worden gemaakt voor elk experiment en afgeschermd van licht. Platen moeten ook worden afgeschermd van licht of verijdeld tijdens deze incubatie. Was de plaat met 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1%Tween-20) gedurende 15 min. Verdun blokkerende reagens tot 2% in Maleic Acid Buffer (100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, pH 7,5). Blokkeer de cellen in dit mengsel gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Vervang de blokkeringsoplossing door anti-digoxygenin-POD antilichaam verdund 1:1.000 in 2% BlokkerenReagenininMaleic Acid Buffer. Incubeer ‘s nachts bij 4 °C. Spoel de plaat 3x af met 1x TBST. Was 4x met 2mL 1x TBST voor minimaal 15 min per wasbeurt met continu schommelen. Was 2x met 1x PBT voor minstens 10 min per wasbeurt met continu schommelen. Verdun Cy3-geconjugeerde tyramide 1:25 in 1x PBT. Was de plaat met 750 μL van deze verdunning gedurende 5 min.OPMERKING: Deze oplossing is extreem lichtgevoelig en platen moeten gedurende de rest van het experiment verijdeld of afgeschermd worden van licht om signaalverslechtering te voorkomen. Voeg 2,5 μL van 0,3% H2O2 toe aan deze oplossing en incubeer met continu schommelen voor nog eens 40 min bij kamertemperatuur. Was 4x met 1x TBST voor minstens 15 min per wasbeurt met continu schommelen. Spoel af met 1x PBT. Repareer de cellen door 1 uur bij kamertemperatuur te broeden in 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA en 1 mM MgSO4 in 3,7% formaldehyde). Verwijder de oplossing en vervang door 1x PBS. Bewaar de platen in een verijdelde container op 4 °C tot verdere verwerking. 6. ImagingCellen OPMERKING: Imaging werd uitgevoerd met behulp van een omgekeerde confocale microscoop. Plaats de monsterplaat op het microscoopstadium, waarbij het merk in stap 3.1 wordt uitgelijnd op de voorkant van het podium. Focus de afbeelding zodat de met raster omzoomde coverslip zichtbaar is en pas met behulp van de rasterafbeelding die in stap 3.4 als referentie is genomen het gezichtsveld aan om het gezichtsveld dat in het calciumbeeld is vastgelegd (sectie 3) aan te passen. Verwerf heldere veldbeelden van zowel het raster als de cellen. Verlicht de monsters met een 595 nm TRITC laser. Pas versterkingswaarden aan om het signaal op de juiste manier van de achtergrond te onderscheiden met behulp van de afbeeldingen van de negatieve controlecellen en een stilstaand beeld te verkrijgen.OPMERKING: Idealiter worden de fluorescentieniveaus op de achtergrond bepaald op basis van een negatieve controleplaat die parallel wordt verwerkt met een niet-targeting sense RNA-sonde. Gain-instellingen worden aangepast zodat deze plaat volledig zwart lijkt (overeenkomend met achtergrondniveaus), en vervolgens constant wordt gehouden voor andere platen die uit die experimentele batch zijn afgebeeld. 7. Gegevensverwerking OPMERKING: De gegevensverwerking werd uitgevoerd met Behulp van Nikon Elements-software. Open het 2 uur calciumbeeld van stap 3.7. Identificeer de pixels die overeenkomen met elke afzonderlijke cel door Binaire > Steundetectie > Lichtpuntjeste selecteren. Controleer of het FITC-kanaal is geselecteerd. Gekleurde cirkels verschijnen boven afzonderlijke cellen nadat deze laag is gegenereerd. Pas de parameters voor celdistributie en -grootte aan, zodat zoveel mogelijk cellen worden herkend en gekoppeld aan een unieke id. Volg de cellen in alle frames van de afbeelding door te navigeren naar Weergave > Analysebesturingselementen > Bijhoudensopties. Stel 5 frames in als de maximale kloof tussen tracks, verwijder objecten die zijn gekoppeld aan minder dan 600 frames en selecteer de optie Hiaten sluiten. Selecteer Binaire bestanden bijhouden om celtracking toe te passen op de afbeelding. Nadat de cellen zijn bijgehouden, verwijdert u handmatig elk object dat niet overeenkomt met een individuele cel (bijvoorbeeld een klomp cellen). Gegevenspunten mogen echter niet worden uitgesloten van verdere analyse op basis van de morfologie van het calciumactiviteitsspoor. Selecteer overlay weergeven > Binaire object-id weergevenin het deelvenster Afbeelding. Schuif naar het einde van de afbeelding (Frame 901) en selecteer Bewerken > Momentopname maken (8bit RGB)> Huidig frame > OK. Hiermee wordt een momentopname van het laatste frame van de afbeelding gemaakt met de bijbehorende binaire ID van elke cel zichtbaar. Sla deze afbeelding op. Exporteer tijdreeksgegevens door alle objecten te selecteren, gevolgd door Gegevens exporteren naar Excel. Uitvoer opslaan als een CSV-bestand. Open de FISH-afbeelding. Optimaliseer de detectie van vlekken zoals in de stappen 7.1–7.2, met behulp van het TRITC-kanaal in plaats van het FITC-kanaal. Verwijder handmatig alle verkeerd toegewezen binaire bestanden en selecteer vervolgens Geautomatiseerde meetresultaten > Meting bijwerken om de signaalintensiteit van elke cel te berekenen. Exporteer een afbeeldingsmomentopname en gegevenstabel door de stappen 7.5 en 7.6 te herhalen. Maak een spreadsheet waarin kolom A het label FISH Binary ID en Kolom B het label Calcium Binary IDheeft. Open de geëxporteerde afbeeldingen in de stappen 7.5 en 7.7. Neem voor elk object dat is geïdentificeerd in de FISH-afbeelding (stap 7.7) de binaire id op in kolom A. Zoek vervolgens de overeenkomstige cel in de calciumafbeelding (stap 7.5) en noteer die binaire ID in kolom B. Cellen die niet met vertrouwen in beide afbeeldingen kunnen worden geïdentificeerd, mogen niet aan de spreadsheet worden toegevoegd.OPMERKING: Het kan handig zijn om een fotobewerkingsprogramma te gebruiken, zoals Adobe Photoshop of GIMP-afbeeldingseditor, om beide afbeeldingen te openen, een semi-transparant te maken en deze op de partnerafbeelding te leggen om de twee binaire id’s die aan elke cel zijn gekoppeld, gemakkelijker te identificeren en te koppelen. Voor elke geïdentificeerde cel, collate (handmatig of met een script) de tijd-serie calcium gegevens (gekoppeld aan de Calcium Binary ID en geëxporteerd in stap 7.6) en de genexpressie gegevens (geassocieerd met de FISH Binary ID en geëxporteerd in stap 7.7).OPMERKING: Downstream-gegevensverwerking en -analyse kunnen inhouden dat deze gegevens in één gegevenstabel worden samengevoegd en dat een scala aan analytische technieken wordt toegepast, waaronder spikecounting, fractale analyse en Markovian-entropie waarmee de onderzoeker nieuwe patronen van calciumactiviteit kan onderscheiden 17,18.