Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes
Summary
Para visualizar e quantificar as características internas dos biofilmes candida albicans, preparamos amostras intactas fixas que são esclarecidas pela correspondência de índice simétrico. Em seguida, a microscopia de secção óptica pode ser usada para obter dados de imagem tridimensionais, embora a espessura total do biofilme.
Abstract
O fungo microbiano Candida albicans pode sofrer uma mudança da colonização commensal para a virulência que está fortemente correlacionada com sua capacidade de mudar do crescimento da forma de levedura para o crescimento hiflárico. As células que estão neste processo tornam-se aderentes às superfícies, bem como umas às outras, com o desenvolvimento resultante de uma colônia de biofilmes. Isso geralmente ocorre não apenas em superfícies de tecido mucosa em infecções por leveduras, mas também em implantes médicos, como cateteres. É sabido que as células biofilme são resistentes a drogas antifúngicas, e que as células que se desfazem do biofilme podem levar a infecções sistêmicas perigosas. Os biofilmes variam de fortemente translúcidos a opacos devido à heterogeneidade refrativa. Portanto, biofilmes fúngicos são difíceis de estudar por microscopia óptica. Para visualizar características estruturais internas, celulares e subcelulares, esclarecemos biofilmes intactos fixos por troca de solventes stepwise a um ponto de correspondência ideal do índice de refração. Para os biofilmes de C. albicans, o esclarecimento suficiente é alcançado com salicilato de metila (n = 1,537) para permitir microscopia confocal do ápice à base em biofilmes de 600 μm com pouca atenuação. Neste protocolo de visualização delineamos refractometria de contraste de fase, crescimento de biofilmes laboratoriais, fixação, coloração, troca de solventes, configuração para microscopia de fluorescência confocal e resultados representativos.
Introduction
Candida albicans é um fungo microbiano que é tipicamente commensal em humanos. É de interesse fundamental para os biólogos porque o organismo tem múltiplas morfologias. Por exemplo, em resposta a certas pistas ambientais ou estressores, as células brotantes em forma de levedura mudarão para o crescimento filamentoso como cadeias septuadas de células altamente alongadas conhecidas como hifas. A transição é importante como exemplo de expressão faiotípica de uma mudança entre um programa de expressão genética unicelular e multicelular. Da mesma forma, C. albicans é de interesse biomédico porque o organismo é um patógeno oportunista bem conhecido. É responsável por infecções de levedura mucosa, como candidíase oral, infecções genitourinárias e causa de infecções invasivas ou sistêmicas perigosas em pacientes imunologicamente enfraquecidos.
O potencial de virulência deste organismo está intimamente ligado aos seus múltiplos morfotipos e outros aspectos de sua versatilidade genética1,2,3,4. A extensão do tubo germinal, o primeiro estágio visível da transição para o crescimento hifásal, ocorre com rapidez suficiente para permitir que as células c. albicans engolidas se rompam dos fagócitos e, assim, escapem de uma fase inicial da resposta imune celular do hospedeiro5. Além disso, a filamento é precedida e acompanhada por um grande aumento na adesão celular-célula e celular-superfície que se deve à expressão regulada de várias classes de proteínas da parede celular conhecidas como adesinas6,7,8,9. uma grande variedade de condições, a combinação de adesão e filamento sustrata uma mudança dramática do crescimento planctônico, unicelular para o crescimento colonial associado à superfície que forma um biofilme. Os biofilmes C. albicans podem desenvolver-se em dispositivos médicos implantados comuns, como cateteres venosos. Infecções disseminadas podem resultar quando esses biofilmes começam a brotar células em forma de levedura e despejá-las em sangue circulante. Vários estudos têm demonstrado que as células biofilme são mais resistentes a drogas antifúngicas do que as células planctônicas10,11, que podem ser devido, em parte, ao metabolismo reduzido12. Além disso, a alta adesão global de um biofilme pode fornecer a ancoragem necessária para o crescimento invasivo eficiente de hifas no tecido hospedeiro1.
O esclarecimento óptico de biofilmes de C. albicans por correspondência de índice sico teve um grande impacto em nossa capacidade de visualizar a estrutura desta comunidade microbiana e descobrir relações entre expressão genética e fenótipo. Biofilmes cultivados em laboratório em superfícies de teste meio de cultura líquida por 48 h aparecem como um revestimento esbranquiçado o suficiente e espesso o suficiente para ser opaco (Figura 1). Portanto, muitas características peletípicas interessantes do biofilme estão escondidas da vista. Os biofilmes do tipo selvagem de 24 horas cultivados em YPD, RPMI-1640 ou spider com 37 °C variam até 300 μm de espessura, com 48 h biofilmes frequentemente atingindo 500 μm. A opacidade é devido à dispersão de luz, que surge da heterogeneidade refrativa: a parede celular fúngica é mais refrativa do que o meio circundante, e o citoplasma ligeiramente mais refrativo que a parede celular. A alta densidade óptica resultante de um biofilme nativo obscurece todas as estruturas com mais de 30 μm de profundidade quando vista com um microscópio convencional ou mesmo um scanner confocal(Figura 2). No entanto, um grande grau de esclarecimento pode ser alcançado infiltrando-se em biofilmes fixos com um líquido de alto índice de refração que corresponde aproximadamente à refratividade dos principais constituintes celulares. Após o esclarecimento, a imagem na resolução submicron pode ser realizada por microscopia confocal através de toda a espessura de quase qualquer biofilme C. albicans 13. Em espécimes do tipo selvagem, é fácil ver que os biofilmes consistem de hifas longas emaranhadas, aglomerados de células de forma de levedura brotadas ou células pseudo-hyphal, espaços vazios, e alguma quantidade de matriz extracelular. Além disso, os biofilmes geralmente são estratificados, mostrando diferenças morfológicas espacialmente variantes no tipo celular, densidade celular e a presença de células brotando ou ramificadas. Muitas variações em uma ou mais dessas características têm sido observadas em biofilmes desenvolvidos por cepas mutantes14,15. Além disso, as cepas dos repórteres mostram in situ diferenças espaciais na expressão genética16,9,13. O surpreendente grau de esclarecimento obtido com esta abordagem relativamente simples e barata também torna possível ver que muitos biofilmes incluem hifas apical e hifas invasivas basais que se estendem até distâncias milimétricas.
Neste protocolo de visualização, demonstramos a fixação, rotulagem, esclarecimento e imagem de um biofilme C. albicans usando um simples marcador de parede celular como uma mancha. A origem da presente versão do protocolo é a melhor clareza observada quando os biofilmes fixos de formaldeído foram infiltrados com 97% de metacrilato glicol (GMA), que foi então polimerizado para incorporar o biofilme em um plástico duro com um índice de refração moderadamente alto (n = 1,49). Em seguida, utilizou-se a microscopia de contraste de fase convencional e uma série de líquidos de referência de índice refrativo para determinar com mais precisão o ponto de reversão de contraste (máxima transparência) do biofilme (Figura 3). Para os biofilmes de C. albicans isso ocorreu perto de n = 1,530, que foi surpreendentemente alto dado que uma estrutura densa de proteína, como a queratina capilar, é apenas um pouco mais refrativa (1,54-1,55). Embora esteja na extremidade superior da faixa ideal na Figura 3,adotamos o salicilato de metila (óleo de wintergreen, n = 1,537) no protocolo atual porque tem sido usado há muito tempo como agente esclarecedor para microscopia em embriologia e histologia, tem baixa toxicidade e baixa pressão de vapor, e deu excelentes resultados em nossos ensaios usando imersões ópticas de óleo moderado-NA.
Quatro pontos devem ser feitos aqui:
(1) Com poucas exceções, a situação ideal na microscopia é que o índice de refração da amostra deve ser igual ao índice de refração do fluido de imersão da lente objetiva17,18,13. Para estudos tridimensionais (3D) de imagem onde o foco profundo é necessário, isso é sempre importante.
(2) Nosso resultado experimental para a limpeza ideal (n = 1.525-1.535) é ligeiramente superior aos óleos de imersão padrão (n = 1.515, 1.518) e, portanto, viola o ponto (1), e, portanto, introduz uma fonte de aberração esférica ao usar a óptica padrão de imersão do óleo. Uma solução para este problema é o uso de um objetivo projetado para um índice de imersão na faixa mais alta. Devido ao ressurgimento do interesse por imagens de amostras limpas, objetivos especiais com a correção necessária estão se tornando disponíveis. A outra solução é ajustar o índice do meio esclarecedor para 1.515 ou 1.518 pela adição de uma pequena quantidade de butanol (n = 1.399) para o desempenho ideal de imersão do óleo, e aceitar a clareza ligeiramente degradada.
(3) A microscopia de biofilmes intactos (e outros espécimes nesta escala) requer uma distância de trabalho significativa para acomodar a espessura da amostra. Esta é uma grande consideração prática. Uma longa distância de trabalho limita a óptica a uma abertura numérica moderada (NA = 0,6-1,25), o que limita a resolução, mas também limita a gravidade da aberração esférica.
(4) O índice de refração ideal para esclarecimento pode ser diferente para outros tipos de amostras fixas. As amostras devem ser testadas em conformidade utilizando contraste de fase e uma série de líquidos de referência de índice refrativo, conforme mostrado na Figura 3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avanços na microscopia de fluorescência em secção óptica, resolução, velocidade, evasão ou compensação de aberração, aquisição multicanal e em poder computacional, causaram um ressurgimento em amostras intactas de imagem. Para espécimes fixos, tanto os métodos clássicos quanto os novos de esclarecimento e expansão tiveram um grande impacto19,20,21,22,23,24. Neste caso, aplicamos uma abordagem rápida e simples de correspondência de índice satisfatoriamente para estudar a estrutura de biofilmes fúngicos que são fortemente translúcidos para opacos.
Os protocolos anteriores foram testados com uma gama de amostras. Em nosso laboratório, os biofilmes Candida albicans são mais frequentemente cultivados em quadrados de 14 mm cortados de uma folha de borracha de silicone de grau médico (ver Tabela de Materiais). Este substrato é usado porque o crescimento em PDMS (poli-dimetilsiloxano) submerso no meio de cultura líquida foi estabelecido como um importante modelo in vitro para infecções associadas a implantes médicos, particularmente cateteres residentes. As células estressadas que instiram filamentos aderem rapidamente a superfícies não polares, como o PDMS. Na prática, os quadrados utilizados que foram limpos e reesterilizados em uma autoclave (ciclo seco) dão os biofilmes mais consistentes para qualquer cepa particular. Biofilmes também são comumente cultivados em copos de cobertura, em pratos de cultura de fundo de vidro de cobertura, em pratos de poliestireno de grau bacteriológico padrão, e em ágar. Como as células C. albicans não aderem bem ao vidro, os vidros de cobertura devem ser tratados com uma lectina que ligará os polissacarídeos da parede celular. Aplicamos 40 μL de 1 mg/mL ou WGA em água estéril em cada superfície de deslizamento de cobertura. Após a secagem, os óculos de cobertura são tratados com 40 μL de glutaraldeído de 1% por 3 min para conectar a proteína a um filme insolúvel. Em seguida, são lavadas com água destilada estéril para remover a lectina solúvel e qualquer lectina solúvel e seca ao ar. Se necessário, os copos ou pratos de capa tratada são reesterilizados uma lâmpada UV germicida por 10 min.
A espessura da amostra afetará os períodos de incubação exigidos nos protocolos. A difusão fixa em um biofilme de 300 μm requer vários minutos para se equilibrar. Este período de tempo aumenta conforme o quadrado da espessura da amostra, e deve ser estendido para uma hora ou mais para biofilmes muito espessos ou espécimes de blocos de ágar que podem ter de 2 a 3 mm de espessura. O período de equilíbrio para a coloração também depende da espessura da amostra, conforme descrito para fixação e lavagem. No entanto, como as lectinas se difundem mais lentamente do que os fixadores de baixo MW, especialmente dentro de um gel de ágar, a coloração deve ser estendida durante a noite. O mesmo deve ser feito para a lavagem do excesso de manchas.
Manchas de vários tipos podem ser incorporadas aos protocolos. Usamos uma mancha de parede celular para imagens estruturais, mais comumente Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) ou uma lectina com tinque de corante, como ConA-Alexafluor 594 ou WGA-Alexafluor 594. Deve-se prestar atenção à valência da proteína. O tetramer pode causar crosslinking de hifas altamente flexíveis na região apical de um biofilme. Isso é menos aparente com o dimer WGA. As especificidades canônicas desses marcadores são Calcofluor para chitin, para resíduos de mannose, e WGA para N-acetil-D-glicosamina e resíduos de ácido sílico.
Como o protocolo de troca de solventes é classificado a partir de PBS ou água embora metanol em salicilato de metila, os recipientes de amostras devem ser resistentes a solventes. O salicilato de metila (MS) amolecerá rapidamente o plástico de poliestireno e amolece lentamente outros plásticos. O protocolo intensifica o uso do metanol puro pode ser realizado em plásticos, mas nesse ponto do protocolo geralmente mudamos para frascos de cintilação de vidro padrão de 20 mL com tampas de parafuso resistentes a solventes. Os frascos são convenientes para biofilmes em substratos quadrados de silicone, pois os quadrados podem ser recolhidos e transferidos usando pinças finas. Além disso, um frasco pode ser drenado e recarregado com o quadrado plano descansando na superfície curva interna para que o biofilme não entre em contato com o vidro. O substrato deve ser biofilme-up quando está imerso no frasco vertical. Os frascos são excelentes para armazenamento de amostras a longo prazo.
No protocolo de esclarecimento, as etapas de troca de solventes mais classificadas minimizam o risco de deformação da amostra devido aos efeitos da mistura de solventes. Para velocidade e conveniência no protocolo básico, há quatro etapas: 1) etapa 3.3, PBS a 50:50 PBS:metanol; 2) passos 3.4 e 3.5, PBS:metanol para metanol puro, 3) passo 3.6, puro metanol até 50:50 metanol:MS; e 4) passos 3.7 e 3.8, metanol:MS para MS puro. Metanol proporciona a miscibilidade transitória. No entanto, como a água e a ESM são quase imiscíveis, é essencial que toda a água seja deslocada por metanol antes da introdução de qualquer MS. Da mesma forma, como o metanol é altamente volátil, é importante deslocar todo o metanol por MS. Caso contrário, o continuado a evaporação do metanol residual causará variações do índice de refração dentro da amostra. Dentro da seqüência de quatro passos, repetir o segundo e quarto passos adicionando outra mudança de solvente puro, ou mesmo uma terceira mudança, é aconselhável. Para espécimes particularmente frágeis, alterações de solventes poderiam ser formuladas em passos menores.
Com espécimes de blocos de ágar, as etapas 3.4 e 3.5 (metanol puro) podem causar o aparecimento de cristais de sal dentro do ágar devido à insolubilidade dos sais residuais de PBS no metanol. Isto pode ser evitado usando água destilada (DW) na primeira etapa de solvente misto no lugar da PBS para diluir sais durante a troca de água:metanol. A seqüência alternativa de troca de solventes para biofilmes fixos consiste então nestas etapas: 1) passo 3.3, transferir a amostra de PBS para 50:50 DW:metanol (permitir tempo extra para difusão através de ágar); 2) etapa 3.4, transferir a amostra de 50:50 DW:metanol para metanol puro (repetir 2x com metanol como na etapa 3.5); 3) etapa 3.6, transferir a amostra de metanol para 50:50 metanol:salicilato de metila; e 4) etapa 3.7, transferir a amostra de 50:50 metanol:MS para mS puro (repetir 2x com MS como na etapa 3.8).
Como o salicilato de metila amolece rapidamente o plástico de poliestireno, usamos uma placa de alumínio anodizado com fundo de vidro de tampa para segurar o biofilme esclarecido no palco de um microscópio invertido. O vidro da tampa é mantido no lugar usando cimento óptico de cura UV (Norland Optical Adhesive #61, ver Tabela de Materiais). Desde que o MS seja removido no final do dia lavando o prato com isopropanol seguido de água com sabão e enxaguando, o vidro de cobertura cimentada servirá por muitos meses.
A seleção objetiva das lentes é extremamente importante na imagem em larga escala de espécimes esclarecidos devido à importância de minimizar a aberração esférica e a necessidade de distância de trabalho suficiente. Temos experiência com três objetivos nesses estudos. Na configuração do microscópio invertido, utilizamos uma longa distância de trabalho, óleo objetivo de abertura numérica moderada (NA) imerso abaixo do vidro de cobertura com o biofilme imerso em salicilato de metila no prato acima do vidro da tampa. A maior parte do nosso trabalho foi feito com um objetivo acromático da série Zeiss Universal, tipo 461708, 40x 0,85NA Oel 160/1.5, usado com um adaptador focal de distância focal de 160 mm negativo para compatibilidade nominal infinita-conjugada (IC). Este objetivo foi originalmente projetado para a visualização imersa em óleo através de lâminas de microscópio de 1,5 mm com distância de trabalho de 0,35 mm25. Quando usado com um vidro de cobertura padrão (0,17 mm), a distância de trabalho é muito maior: 1,5 + 0,35-0,17 = 1,68 mm = 1.680 μm. Também utilizamos um novo objetivo de multi-imersão Zeiss, tipo 420852, 25x 0,8NA LD LCI Plan-apochromat com uma distância de trabalho superior a 540 μm, com a correção de imersão definida para o lado alto do ‘óleo’. Este objetivo é altamente corrigido e produz uma imagem soberba. Em um suporte de microscópio vertical, usamos um novo objetivo de multi-imersão Nikon, tipo MRD71120, 10x 0,5NA CFI Plan-apochromat com uma distância de trabalho superior a 5.000 μm (5 mm), também com a correção de imersão definida para o lado alto do ‘óleo’ (n = 1.518). Embora este objetivo tenha um NA menor do que os outros, ele tem a vantagem de ser diretamente imersível em salicilato de metila.
Para otimizar a aquisição de dados em termos de velocidade e resolução, as configurações de microscópio confocal idealmente devem atender tanto às densidades de amostragem transversa e axial de Nyquist18. Utilizando critérios convencionais, defina nominalmente o diâmetro do orifício confocal para 1 unidade arenosa. Em coordenadas ampliadas,
dP (μm) = 1,22 x ampliação x (comprimento de onda de emissão em μm) / NA
A amostragem transversal (espaçamento de pixels) não deve exceder (1/2) x o limite de resolução de Abbe. Em coordenadas de espaço-objeto,
♦x, ¥y = (comprimento de onda de emissão em nm) / (4 NA)
A amostragem axial (incremento de foco) não deve exceder a largura de banda axial inversa,
♦z = (índice de imersão) x (comprimento de onda de emissão em nm) / (NA2)
O sistema óptico confocal expande a largura de banda do microscópio e aguça a resolução transversal e axial em pelo menos 1/⁄2.
Para o objetivo de 40x 0,85 NA que utilizamos com mais frequência, consulte a Tabela 1 para obter os resultados dessas fórmulas para um comprimento de onda de emissão de 600 nm (Alexa Fluor 594).
| Fórmula | x 1/⁄2 | conjunto (típico) | |
| dP (μm) | 34,5 μm | – | 25 ou 50 μm |
| ♦x, ¥y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| ♦z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tabela 1: Diâmetro do orifício confocal, amostragem transversal e valores de amostragem axial para um comprimento de onda de emissão de 600 nm.
Usando um scanner confocal de disco giratório com essas configurações e um campo de varredura de 1.392 x 1.040 pixels, os dados das amostras de biofilme podem ser adquiridos com velocidade e resolução razoáveis. As pilhas de imagens 3D típicas de cor única são executadas entre 0,35 e 1,55 GB.
Os meios de comunicação de amplo uso abrangem uma faixa significativa de índice de refração. Por iluminação de campo escuro e inspeção visual, descobrimos que os biofilmes fixos C. albicans eram mais transparentes acima de n = 1,5. Esta foi refinada por microscopia de contraste de fase para n = 1.530-1.535. Por uma série de razões práticas, utilizamos salicilato de metila (n = 1,537) como solvente de correspondência de índice final. Embora a troca de solventes traga o risco de deformação de espécimes ou outros artefatos, as células em espécimes fixos e esclarecidos têm dimensões corporais semelhantes, diâmetro do hipha e dimensões do comprimento interseptal como espécimes vivos.
Muitas variações no processo de troca de solventes são possíveis (por exemplo, usando um solvente transitório diferente, ou um solvente final diferente). O metanol foi escolhido por sua alta polaridade e difusão rápida, mas o etanol mostrou-se melhor para preservar melhor o rendimento quântico da proteína fluorescente vermelha (RFP)26 como solvente transitório. O salicilato de metila foi selecionado por seu índice, polaridade moderada, baixa pressão de vapor e compatibilidade com muitas manchas, corantes e proteínas fluorescentes. No entanto, um solvente final com índice ligeiramente menor, ou uma mistura de salicilato de metila e um solvente de índice mais baixo, como butanol, pode servir melhor.
Inesperadamente, a capacidade de ver através de um biofilme revela não apenas suas características internas estratificadas, mas também auxilia na visualização da origem de estruturas estendidas como hifas apical longas, não emaranhadas e hifaes basais invasivas em certos substratados. A virulência oportunista em C. albicans depende de sua versatilidade genética (ou seja, mudança para crescimento hifal, regulação do substrato celular e adesão celular-célula, geração de osmólitos para brotação celular e alongamento, e uso de nutrientes alternativos). A extensão hifábula permite a fuga de células c. albicans individuais de células imunes fagocíticas, mas também é essencial para a invasão. A adesão ao biofilme e o entrelaçamento hifal parecem fornecer a ancoragem de superfície necessária para que as hifas invadam eficientemente um substrato. Quando esse substrato é tecido hospedeiro, o aumento da virulência pode resultar.
Biofilmes intactos de imagens permitem um grande número de experimentos informativos utilizando cepas de repórteres para expressão genética, substrata de tecido modelo e a inclusão de outros organismos, como bactérias encontradas em biofilmes naturais. Mesmo no caso mais simples de imagens puramente estruturais com uma mancha de parede celular, são revelados fenótipos in situ que, em seguida, podem ser quantificados e geneticamente analisados.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelas bolsas NIH R01 AI067703, R21 AI100270 e R21 AI135178 para A.P. Mitchell. Os autores são gratos a Greenfield ‘Kip’ Sluder por fornecer o objetivo de imersão de óleo de longa distância usado neste trabalho, e a Daniel Shiwarski para microscopia confocal com imersão direta de salicilato de metila.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
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