Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler
Summary
Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.
Abstract
Mikrobiyal mantar Candida albicans güçlü bir şekilde hiphal büyüme için maya formu büyüme geçiş yeteneği ile ilişkili virülans commenal kolonizasyon bir değişiklik uğrayabilir. Bu süreci başlatan hücreler, bir biyofilm kolonisinin gelişmesiyle birlikte yüzeylere ve birbirlerine yapışırlar. Bu genellikle mantar enfeksiyonlarında mukozal doku yüzeylerinde değil, kateterler gibi tıbbi implantlarda da görülür. Biyofilm hücrelerinin antifungal ilaçlara dirençli olduğu ve biyofilmden dökülen hücrelerin tehlikeli sistemik enfeksiyonlara yol açabileceği bilinmektedir. Biyofilmler kırılma heterojenliğine bağlı olarak ağır yarı saydamdan opaklığa kadar değişmektedir. Bu nedenle, mantar biyofilmleri optik mikroskopi ile çalışmak zordur. İç yapısal, hücresel ve hücre altı özellikleri görselleştirmek için, sabit bozulmamış biyofilmleri adım adım çözücü değişimi ile optimum kırılma indisi eşleştirme noktasına netleştiririz. C. albicans biyofilmleri için, az zayıflama ile 600 μm biyofilmde apeksten baza konfokal mikroskopiyi sağlamak için metil salisilat (n = 1.537) ile yeterli açıklama elde edilir. Bu görselleştirme protokolünde faz kontrastrefraktometrisi, laboratuvar biyofilmlerinin büyümesi, fiksasyon, boyama, solvent değişimi, konfokal floresan mikroskopi nin kurulumu ve temsili sonuçlar sıralanmaktadır.
Introduction
Candida albicans genellikle insanlarda kommenson bir mikrobiyal mantardır. Biyologlar için temel bir ilgi alanıdır çünkü organizmanın birden fazla morfolojisi vardır. Örneğin, bazı çevresel ipuçları veya stres yanıt olarak, maya-form tomurcuklanma hücreleri hyphae olarak bilinen yüksek uzun hücrelerin septating zincirleri olarak ipliksi büyümeye geçecektir. Geçiş tek hücreli ve çok hücreli gen ekspresyonu programı arasında bir geçiş in selotipik ifade bir örnek olarak önemlidir. Aynı şekilde, C. albicans biyomedikal ilgi çünkü organizma iyi bilinen fırsatçı patojen. Pamukçuk (oral kandidiaz), genitoüriner enfeksiyonlar ve immünolojik olarak zayıflamış hastalarda tehlikeli invaziv veya sistemik enfeksiyonların bir nedeni gibi mukozal mantar enfeksiyonları sorumludur.
Bu organizmanın virülans potansiyeli yakından çoklu morfotipleri ve genetik çok yönlülükdiğeryönleri ilebağlantılıdır 1 ,2,3,4. Mikrop tüpü uzantısı, hyphal büyümesine geçişin ilk görünür aşaması, yeterli hızla oluşur yuttu C. albicans hücreleri fagositler kırmak ve böylelikle konak hücresel bağışıklık yanıtının erken bir faz kaçmak sağlamakiçin 5. Ayrıca, filamentasyon öncesinde ve hücre-hücre ve hücreden yüzeye bağlılık büyük bir artış ile birlikte olan hücre duvarı proteinleri çeşitli sınıfların düzenlenmiş ifade nedeniyle adhesins olarak bilinen6,7,8,9. Çok çeşitli koşullar altında, bağlılık ve filamentasyon kombinasyonu planktonik dramatik bir kayma ile sonuçlanır, tek hücreli büyüme bir biyofilm oluşturan yüzey ilişkili sömürge büyüme. C. albicans biyofilmler venöz kateterler gibi yaygın implante tıbbi cihazlarda gelişebilir. Bu tür biyofilmler maya-form hücreleri kapalı tomurcuk ve dolaşan kan içine döken başladığında disemine enfeksiyonlar neden olabilir. Birden fazla çalışma biyofilm hücrelerinin planktonik hücrelerden daha antifungal ilaçlara karşı daha dirençli olduğunu göstermiştir10,11, kısmen düşük metabolizma nedeniyle olabilir12. Ayrıca, bir biyofilmin yüksek genel yapışma ev sahibi doku içine hyphae verimli invaziv büyüme için gerekli çapa sağlayabilir1.
C. albicans biyofilmlerinin kırılma indisi eşleştirmesi ile optik olarak açıklanması, bu mikrobiyal topluluğun yapısını görselleştirme ve gen ekspresyonu ile fenotip arasındaki ilişkileri keşfetme yeteneğimiz üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Laboratuvarda 48 saat sıvı kültür ortamı altında test yüzeylerinde yetiştirilen biyofilmler, opak olacak kadar yoğun ve kalın beyazımsı bir kaplama olarak görünürler (Şekil 1). Bu nedenle, biyofilmin birçok ilginç henotik özellikleri görünümden gizlidir. YPD, RPMI-1640 veya Örümcek ortamda 37 °C’de 300°C kalınlığında yetiştirilen 24 saatlik yabani tip biyofilmler, 48 h biyofilm genellikle 500 μm’ye ulaşır. Opaklık, kırılma heterojenitesinden kaynaklanan ışık saçılımından kaynaklanmaktadır: mantar hücre duvarı çevredeki ortama göre daha kırılmaz ve sitoplazma hücre duvarından biraz daha kırılır. Yerli bir biyofilmin ortaya çıkan yüksek optik yoğunluğu, geleneksel bir mikroskop ve hatta konfokal tarayıcı ile bakıldığında 30 μm’den daha derin olan tüm yapıları gizler (Şekil 2). Ancak, yaklaşık büyük hücresel bileşenlerin kırılması eşleşen yüksek kırılma indeksli sıvı ile sabit biyofilmler sızma ile açıklama büyük ölçüde elde edilebilir. Açıklama dan sonra, submikron çözünürlüğünde görüntüleme hemen hemen her C. albicans biofilm13tüm kalınlığı ile konfokal mikroskopi ile yapılabilir. Yabani tip örneklerde, biyofilmlerin uzun dolaşmış hyphae, tomurcuklanmış maya-form hücreleri veya psödohyphal hücreleri kümeleri, boşluk boşluklar ve hücre dışı matris bir miktar oluşur görmek kolaydır. Ayrıca, biyofilmler genellikle tabakalaşmış, hücre tipi, hücre yoğunluğu ve tomurcuklanma veya dallanma hücrelerinin varlığı mekansal varyant morfolojik farklılıklar gösteren. Bu özelliklerin bir veya daha fazla birçok varyasyonmutant suşları tarafından geliştirilen biyofilmlerde gözlenmiştir14,15. Ayrıca, muhabir suşları gen ekspresyonunda mekansal farklılıklar gösterir16,9,13. Bu nispeten basit ve ucuz yaklaşım ile elde edilen açıklama şaşırtıcı derecesi de birçok biyofilm milimetre mesafelere uzanan apikal hyphae ve bazal invaziv hyphae içerdiğini görmek mümkün kılar.
Bu görselleştirme protokolünde, basit bir hücre duvarı işaretleyicisini leke olarak kullanarak C. albicans biyofilminin düzeltilmesini, etiketlendiğini, açıklamasını ve görüntülendiğini gösteriyoruz. Protokolün mevcut versiyonunun kökeni, formaldehit-sabit biyofilmlerin %97 glikol metakrilat (GMA) ile sızdığı zaman gözlemlediğimiz ve biyofilmi orta derecede yüksek kırılma indisi olan sert bir plastikle yerleştirmek için polimerize edilen geliştirilmiş netliktir (n = 1.49). Daha sonra biyofilmin kontrast tersine çevirme noktasını (maksimum saydamlık) daha doğru bir şekilde belirlemek için konvansiyonel faz kontrast mikroskobu ve bir dizi kırılma indisi referans sıvısı kullandık (Şekil 3). C. albicans biyofilmleri için bu durum n = 1.530’a yakın meydana geldi ve saç keratini gibi yoğun bir protein yapısının sadece biraz daha kırılması (1.54-1.55) olduğu düşünülürse şaşırtıcı derecede yüksekti. Şekil 3’tekioptimal aralığın üst ucunda olmasına rağmen, uzun zamandır embriyoloji ve histolojide mikroskopi için açıklayıcı bir ajan olarak kullanıldığı için mevcut protokolde metil salisilat (wintergreen yağı, n = 1.537) benimsedik, düşük toksisite ve düşük buhar basıncına sahip ve orta-NA yağı daldırma optikleri kullanarak denemelerimizde mükemmel sonuçlar verdi.
Dört puan burada yapılmalıdır:
(1) Birkaç istisna dışında, mikroskopide ideal durum, numunenin kırılma indeksi objektif lens daldırma sıvısı17,18,13kırılma indisi eşit olmalıdır . Derin odaklamanın gerekli olduğu üç boyutlu (3D) görüntüleme çalışmaları için bu her zaman önemlidir.
(2) Optimal temizleme için deneysel sonuç (n = 1.525-1.535) standart daldırma yağları (n = 1.515, 1.518) biraz daha yüksek ve bu nedenle noktası ihlal (1) ve böylece standart yağ daldırma optik kullanırken küresel sapma kaynağı tanıttı. Bu sorunun bir çözümü, daha yüksek aralıktaki bir daldırma dizini için tasarlanmış bir hedefin kullanılmasıdır. Temizlenmiş numunelerin görüntülenmesine olan ilginin yeniden canlanması nedeniyle, gerekli düzeltmeile özel hedefler kullanıma sunulmuştur. Diğer çözüm, optimum yağ daldırma performansı için az miktarda butanol (n = 1,399) ekleyerek 1,515 veya 1,518’e kadar olan açıklığa kavuşturulan ortamın indeksini ayarlamak ve biraz bozulmuş netliği kabul etmektir.
(3) Bozulmamış biyofilmlerin (ve bu ölçekteki diğer örneklerin) mikroskopisi, numune kalınlığını karşılamak için önemli bir çalışma mesafesi gerektirir. Bu önemli bir pratik husustur. Uzun çalışma mesafesi optikleri, çözünürlüğü sınırlayan ancak küresel sapmanın şiddetini de sınırlayan ılımlı bir sayısal diyafram açıklığıyla (NA = 0.6-1.25) sınırlar.
(4) Açıklama için optimal kırılma indisi diğer sabit numune türleri için farklı olabilir. Örnekler, Şekil 3’tegösterildiği gibi faz kontrastı ve bir dizi kırılma indisi referans sıvısı kullanılarak buna göre test edilmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optik kesit, çözünürlük, hız, kaçınma veya sapma, çok kanallı edinim ve bilgi işlem gücünde floresan mikroskopideki gelişmeler, sağlam örneklerin görüntülenmesinde yeniden canlanmaya neden olmaktadır. Sabit numuneler için, hem klasik hem de yeni açıklama ve genişletme yöntemleri büyük bir etkisi olmuştur19,20,21,22,23,24. Bu durumda, opak olarak aşırı yarı saydam olan mantar biyofilmlerinin yapısını incelemek için hızlı ve basit bir solvent bazlı indeks eşleştirme yaklaşımı uyguladık.
Önceki protokoller çeşitli örneklerle test edilmiştir. Laboratuvarımızda Candida albicans biyofilmler en sık tıbbi sınıf silikon kauçuk bir levha kesilmiş 14 mm kareler üzerinde yetiştirilen (Malzeme Tablosubakınız). Bu substratum, sıvı kültür ortamına batık PDMS (poli-dimethylsiloxane) büyüme tıbbi implantlar ile ilişkili enfeksiyonlar için önemli bir in vitro model olarak kurulmuştur, çünkü kullanılır, özellikle indwelling kateterler. Filamentasyonu başlatan stresli hücreler PDMS gibi polar olmayan yüzeylere hızlı bir şekilde yapışır. Uygulamada, otoklavda (kuru çevrim) temizlenmiş ve yeniden sterilize edilmiş kullanılan kareler, herhangi bir tür için en tutarlı biyofilmleri verir. Biyofilmler de yaygın kapak gözlük, kapak cam alt kültür yemekleri, standart bakteriyolojik sınıf polistiren yemekler ve agar yetiştirilir. C. albicans hücreleri cam iyi yapışmaz çünkü, kapak gözlük hücre duvarı polisakkaritler bağlayacak bir lektin ile tedavi edilmelidir. Steril suya 40 mg/mL 1 mgL ConA veya WGA uygularız. Kuruduktan sonra, kapak gözlükleri proteini çözünmez bir filme bağlamak için 3 dk boyunca %1 glutaraldehit 40 μL ile tedavi edilir. Daha sonra fiksatif ve herhangi bir çözünür lektin kaldırmak ve hava kurutulmuş steril distile su ile yıkanır. Gerekirse, tedavi kapak bardakları veya bulaşıkları 10 dakika boyunca mikrop öldürücü UV lambası altında yeniden sterilize edilir.
Numune kalınlığı protokollerde gerekli kuluçka sürelerini etkileyecektir. 300 μm biyofilm içine fiksatif difüzyon dengelemek için birkaç dakika gerektirir. Bu süre numune kalınlığının karesi olarak artar ve 2-3 mm kalınlığında olabilecek çok kalın biyofilmler veya agar blok numuneleri için bir saat veya daha fazla uzatılmalıdır. Boyama için denge süresi de sabitleme ve yıkama için açıklandığı gibi numune kalınlığına bağlıdır. Ancak, lektinler düşük MW fiksatifler daha yavaş yayılır çünkü, özellikle bir agar jel içinde, boyama bir gecede uzatılmalıdır. Aynı aşırı leke yıkama için yapılmalıdır.
Protokollere çeşitli tipte lekeler dahil edilebilir. Biz yapısal görüntüleme için bir hücre duvarı lekesi kullanın, en yaygın Calcofluor Beyaz M2R (Flor. Aydınlatıcı #28) veya ConA-Alexafluor 594 veya WGA-Alexafluor 594 gibi boya etiketli lektin. Proteinin değerine dikkat edilmelidir. ConA tetramer bir biyofilm apikal bölgede son derece esnek hyphae crosslinking neden olabilir. Bu WGA dimer ile daha az belirgindir. Bu belirteçlerin kanonik özellikleri kitin için Calcofluor, mannose artıkları için ConA ve N-asetil-D-glukozamin ve siyalik asit kalıntıları için WGA’dır.
Çözücü değişim protokolü PBS veya su metil salisilat içine metanol rağmen dereceli olduğundan, numune kapları solvent dayanıklı olmalıdır. Metil salisilat (MS) hızlı polistiren plastik ve yavaş yavaş diğer plastik yumuşatmak yumuşatır. Protokol, düzgün metanol kullanımına kadar plastik olarak yapılabilir, ancak protokoldeki bu noktada genellikle solvente dayanıklı vida kapakları ile standart 20 mL cam ışıltılı şişelere geçeriz. Kareler alınıp ince cımbızkullanılarak aktarılabildiği için şişeler silikon kare substrat üzerindeki biyofilmler için uygundur. Ayrıca, bir şişe drene edilebilir ve biyofilm cam temas etmez, böylece iç kavisli yüzey üzerinde istirahat düz kare ile doldurulur. Substratum dik şişeye daldırıldığında biyofilm-up olmalıdır. Şişeler uzun süreli numune depolamaiçin mükemmeldir.
Açıklama protokolünde, daha fazla dereceli solvent değişim adımları solvent karıştırma etkileri nedeniyle numune deformasyonu riskini en aza indirir. Temel protokolde hız ve rahatlık için dört adım vardır: 1) adım 3.3, PBS için 50:50 PBS:metanol; 2) adımlar 3.4 ve 3.5, PBS:metanol düzgün metanol, 3) adım 3.6, 50:50 metanol için düzgün metanol:MS; ve 4) adımlar 3.7 ve 3.8, metanol:MS düzgün MS. Metanol geçiş miscibility sağlar. Ancak, su ve MS neredeyse immiscible olduğundan, tüm su herhangi bir MS giriş önce metanol tarafından yerinden olması esastır. artık metanolbuharlaşması numune içinde kırılma indisi varyasyonları neden olacaktır. Dört adım sırası içinde, düzgün çözücü başka bir değişiklik, hatta üçüncü bir değişiklik ekleyerek ikinci ve dördüncü adımları tekrarlama, tavsiye edilir. Özellikle kırılgan numuneler için çözücü değişimleri daha küçük yüzde basamaklarda formüle edilebilir.
Agar blok örnekleri ile, adımlar 3.4 ve 3.5 (düzgün metanol) metanol artık PBS tuzları çözünmezlik nedeniyle agar içinde tuz kristallerinin görünümünü neden olabilir. Bu su sırasında tuzları seyreltmek için PBS yerine ilk karışık çözücü adımda distile su (DW) kullanılarak önlenebilir: metanol değişimi. Sabit biyofilmler için alternatif solvent değişim sırası sonra şu adımlardan oluşur: 1) adım 3.3, 50:50 DW:metanol içine PBS örnek transferi (agar yoluyla difüzyon için ekstra zaman sağlar); 2) adım 3.4, 50:50 DW:metanol düzgün metanol içine örnek transferi (adım 3.5 gibi metanol ile 2x tekrarlayın); 3) adım 3.6, 50:50 metanol için metanol örnek transferi:metil salisilat; ve 4) adım 3.7, 50:50 metanol:MS temiz MS (adım 3.8 gibi MS ile 2x tekrar) için örnek aktarın.
Metil salisilat hızlı bir şekilde polistiren plastik yumuşatır çünkü, ters bir mikroskop aşamasında açıklık biyofilm tutmak için bir kapak cam alt ile anodize alüminyum çanak kullanın. Kapak camı UV küroptik çimento kullanılarak yerinde tutulur (Norland Optik Yapıştırıcı #61, Malzeme Tablosu’nabakınız). MS izopropanol ile sabunlu su ve durulama ardından bulaşık yıkayarak günün sonunda kaldırılır sağlanan, çimentolu kapak cam aylarca hizmet verecek.
Küresel sapmayı en aza indirmenin önemi ve yeterli çalışma mesafesi ihtiyacı nedeniyle, açıklığa kavuşturulmuş örneklerin büyük ölçekli görüntülemesinde objektif lens seçimi kritik öneme sahiptir. Bu çalışmalarda üç hedefle tecrübemiz var. Ters mikroskop kurulumunda, kapak camı üzerindeki çanakta metil salisilata batırılmış biyofilm ile kapak camı nın altına batırılmış uzun bir çalışma mesafesi, orta sayısal diyafram (NA) nesnel yağ kullanıyoruz. Çalışmalarımızın çoğu zeiss Universal serisi akromatik hedefi, tip 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, nominal sonsuz eşlenik (IC) uyumluluğu için negatif 160 mm odak uzaklığı adaptörü ile yapılmıştır. Bu amaç başlangıçta 0,35 mm çalışma mesafesi25ile 1,5 mm mikroskop slaytlar ile yağ daldırma görüntüleme için tasarlanmıştır. Standart bir kapak camı (0,17 mm) ile kullanıldığında çalışma mesafesi çok daha fazladır: 1,5 + 0,35-0,17 = 1,68 mm = 1,680 m. Ayrıca yeni bir Zeiss çoklu daldırma hedefi, tip 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat 540 μm aşan bir çalışma mesafesi ile, daldırma düzeltme ‘yağ’ yüksek tarafına ayarlanmış kullanın. Bu amaç son derece düzeltilmiş ve mükemmel bir görüntü üretir. Dik bir mikroskop standında, yeni bir Nikon çoklu daldırma hedefi, MRD71120 tipi, 5.000 μm (5 mm) çalışma mesafesi ile 10x 0.5NA CFI Plan-apochromat, ayrıca ‘yağ’ (n = 1.518) yüksek tarafına daldırma düzeltme ile kullandık. Bu hedef diğerlerinden daha düşük bir NA’ya sahip olsa da, metil salisilata doğrudan daldırılmak avantajına sahiptir.
Hız ve çözünürlük açısından veri alımını optimize etmek için, konfokal mikroskop ayarları ideal hem enine hem de eksenel Nyquist örnekleme yoğunlukları18karşılanmalıdır. Konvansiyonel kriterleri kullanarak, confocal iğne deliği çapını nominal olarak 1 Havadar üniteye ayarlayın. Büyütülmüş koordinatlarda,
dP (μm) = 1,22 x büyütme x (μm’de emisyon dalga boyu) / NA
Enine örnekleme (piksel aralığı) x Abbe’nin çözünürlük sınırını (1/2) aşmamalıdır. Nesne-uzay koordinatlarında,
(nm’de emisyon dalga boyu) / (4 NA)
Eksenel örnekleme (odak artış) ters eksenel bant genişliğini aşmamalı,
≥z = (daldırma indeksi) x (nm’de emisyon dalga boyu) / (NA2)
Konfokal optik sistem mikroskobun bant genişliğini genişletir ve hem enine hem de eksenel çözünürlüğü en az 1/√2 ile keskinleştirir.
En sık yararlandığımız 40x 0.85 NA hedefi için, 600 nm emisyon dalga boyu için bu formüllerin sonuçları için Tablo 1’e bakınız (Alexa Fluor 594).
| Formül | x 1/√2 | set (tipik) | |
| dP (μm) | 34,5 μm | – | 25 veya 50 m |
| (x), (y) | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
| ≥z | 1200 nm | 848 nm | 900 nm |
Tablo 1: 600 nm emisyon dalga boyu için konfokal iğne deliği çapı, enine örnekleme ve eksenel örnekleme değerleri.
Bu ayarlara sahip bir dönen disk konfokal tarayıcı sı ve 1.392 x 1.040 piksel lik bir tbmkografi alanı kullanılarak, biyofilm örneklerinden elde edilen veriler makul hız ve çözünürlükte elde edilebilir. Tipik tek renkli 3B görüntü yığınları 0,35-1,55 GB çalıştırın.
Geniş kullanımda açıklama ortamı önemli bir kırılma indeks aralığına yayılır. Darkfield aydınlatma ve görsel inceleme ile, sabit C. albicans biyofilm n = 1.5 üzerinde en şeffaf olduğunu bulundu. Bu durum faz kontrast mikroskobu ile n = 1.530-1.535’e kadar rafine edilmiştir. Bir dizi pratik nedenden dolayı, son indeks eşleştirme çözücü olarak metil salisilat (n = 1.537) kullanıyoruz. Solvent değişimi numune deformasyonu veya diğer objeler riskini getirse de, sabit, netleştirilmiş numunelerde bulunan hücreler canlı numuneler gibi benzer hücre gövdesi boyutlarına, hypha çapına ve interseptal uzunluk boyutlarına sahiptir.
Solvent değişim sürecinde birçok varyasyon mümkündür (örneğin, farklı bir geçiş çözücü kullanarak, ya da farklı bir son çözücü). Metanol yüksek polarite ve hızlı difüzyon için seçildi, ancak etanol daha iyi kırmızı floresan protein korumak için gösterilmiştir (RFP) kuantumverimi 26 bir geçiş çözücü olarak. Metil salisilat indeks, orta polarite, düşük buhar basıncı ve birçok leke, boya ve floresan proteinile uyumluluk için seçilmiştir. Ancak, biraz daha düşük indeksli son bir çözücü, ya da metil salisilat karışımı ve daha düşük indeks çözücü, butanol gibi, daha iyi hizmet verebilir.
Beklenmedik bir şekilde, bir biyofilm aracılığıyla görmek yeteneği sadece tabakalaşmış iç özellikleri ortaya koymaktadır, ama aynı zamanda bazı substrat üzerinde uzun, unentangled apikal hyphae ve invaziv bazal hyphae gibi genişletilmiş yapıların kökeni görüntüleme yardımcı olur. C. albicans fırsatçı virülans genetik çok yönlülük bağlıdır (yani, hiphal büyüme geçiş, hücre substratum ve hücre-hücre bağlılığı upregulation, hücre tomurcuklanma ve uzama için osmolit üretimi, ve alternatif besin lerin kullanımı). Hipür uzantısı fagositik bağışıklık hücrelerinden bireysel C. albicans hücrelerinin koparma sağlar ama aynı zamanda invazyon için gereklidir. Biyofilm yapışma ve hiphal dolaşıklık, hyphae’nin bir substratumu verimli bir şekilde istila etmesi için gerekli yüzey demirlemesini sağlar. Bu substratum konak doku olduğunda, artan virülans neden olabilir.
Sağlam biyofilmlerin görüntülenmesi, gen ekspresyonu, model doku substratı ve doğal biyofilmlerde bulunan bakteriler gibi diğer organizmaların dahil edilmesi için muhabir suşlarını kullanan çok sayıda bilgilendirici deney yapılmasını sağlar. Hücre duvarı lekesi ile tamamen yapısal görüntüleme basit durumda bile, yerinde fenotipler daha sonra sayısal ve genetik olarak analiz edilebilir ortaya çıkar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma kısmen NIH’nin A.P. Mitchell’a R01 AI067703, R21 AI100270 ve R21 AI135178’i bağışlayarak desteklenmiştir. Yazarlar Greenfield ‘Kip’ Sluder için uzun çalışma mesafesi petrol daldırma amacı bu çalışmada kullanılan sağlamak için minnettar, ve Daniel Shiwarski doğrudan metil salisilat daldırma ile konfokal mikroskopi için.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
References
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E., Yuste, R. M. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. , 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
