澄清和成像念珠菌生物膜

荧光显微镜在光学切片、分辨率、速度、避免或补偿畸变、多通道采集和计算能力方面的进步，使成像完整标本重新出现。对于固定标本，古典和新颖的澄清和扩展方法都产生了重大影响19，20，21，22，23，24。在这种情况下，我们应用了一种快速而简单的溶剂基指数匹配方法，以研究具有严重半透明性到不透明的真菌生物膜的结构。

前面的协议已经用一系列试样进行了测试。在我们的实验室中，念珠菌生物膜通常生长在14毫米的正方形上，从医疗级硅橡胶片中切割（参见材料表）。之所以使用这种下层，是因为浸于液体培养基中的PDMS（聚二甲基硅氧烷）的生长被确定为与医疗植入物相关的感染的重要体外模型，特别是浸入导管。启动丝丝的应力细胞会迅速附着在非极性表面，如PDMS。实际上，在高压灭菌器（干循环）中清洗和重新加工的所用方块为任何特定菌株提供最一致的生物膜。生物膜也通常种植在盖眼镜，盖玻璃底培养皿，在标准细菌级聚苯乙烯菜肴，和阿加。由于C.白化糖细胞不能很好地粘附在玻璃上，盖眼镜应该用一种将细胞壁多糖结合的支体进行治疗。我们在无菌水中将40μL的1mg/mL ConA或WGA涂到每个盖玻片表面。干燥后，盖眼镜用40μL的1%谷氨酸处理3分钟，将蛋白质交叉到不溶性薄膜中。然后用无菌蒸馏水清洗，以去除固定和任何可溶性的克丁和风干。如有必要，经过处理的盖眼镜或洗碗在杀菌紫外线灯下冷藏10分钟。

试样厚度将影响协议中所需的孵育期。固定扩散到300μm生物膜需要几分钟才能平衡。此时间段会随着试样厚度的平方增加而增加，对于厚度极厚的生物膜或厚度为 2⁄3 mm 的 agar 块试样，应延长到一小时或更长时间。染色的均衡时间也取决于用于固定和冲洗的试样厚度。然而，由于支气口扩散速度比低MW固定剂慢，特别是在加胶凝胶内，染色应延长一夜。冲洗多余的污渍时也应这样做。

各种类型的污渍可以纳入协议。我们使用细胞壁污渍进行结构成像，最常见的是Calcofluor白M2R（氟。增亮剂#28）或染料标记的力克剂，如ConA-Alexafluor 594或WGA-Alexafluor 594。应注意蛋白质的含量。ConA 四面体可能导致在生物膜的尖峰区域中导致高度柔性催眠的交联。这在 WGA 二分器中不太明显。这些标记物的规范特性是甲酸钙素的钙氟醇、曼鼻残留物的ConA和用于N-乙酰-D-葡萄糖胺和胆酸残留物的WGA。

由于溶剂交换协议从PBS或水通过甲醇分级成甲基水杨酸，试样容器必须耐溶剂。甲基水杨酸盐 （MS） 可快速软化聚苯乙烯塑料制品，并缓慢软化其他塑料。协议步骤到使用整齐的甲醇可以在塑料制品中进行，但在协议中，我们一般切换到标准的20 mL玻璃闪烁瓶与防溶剂螺丝帽。小瓶对于硅胶方形亚地层上的生物膜来说很方便，因为方块可以用细钳子拾取和转移。此外，小瓶可以排空，用平方形在内曲面上重新填充，使生物膜不接触玻璃。底层应是生物膜，当它浸入直立小瓶。小瓶非常适合长期标本储存。

在澄清协议中，更分级的溶剂交换步骤将样品变形的风险降至最低，因为溶剂混合效果。为了在基本协议中速度和方便，有四个步骤：1）步骤3.3，PBS到50：50PBS：甲醇;2）步骤3.4和3.5，PBS：甲醇到整洁甲醇，3）步骤3.6，整洁甲醇至50：50甲醇：MS;和4）步骤3.7和3.8，甲醇：MS整洁MS甲醇提供过渡误区。然而，由于水和MS几乎不可理解，因此，在引入任何MS之前，所有水都必须被甲醇取代。 同样，由于甲醇挥发性极高，因此必须用MS取代所有甲醇。残余甲醇的蒸发会导致试样内的折射率变化。在四个步骤序列中，建议通过添加另一个整齐的溶剂，甚至第三个变化来重复第二步和第四步。对于特别脆弱的标本，溶剂变化可以以较小的百分比步骤进行配制。

使用 a加块试样，步骤 3.4 和 3.5（正用甲醇）可能会导致在 agar 内出现盐晶体，因为甲醇中残留的 PBS 盐不溶性。在水：甲醇交换过程中，在第一个混合溶剂步骤中使用蒸馏水 （DW） 代替 PBS 稀释盐，可以避免这种情况。固定生物膜的替代溶剂交换序列包括以下步骤：1） 步骤 3.3，将试样从 PBS 转移到 50：50 DW：甲醇（允许额外的时间通过 agar 扩散）;2） 步骤 3.4，将试样从 50：50 DW：甲醇转移到整洁的甲醇中（重复 2 倍，与步骤 3.5 中的甲醇一起重复）;3）步骤3.6，将试样从甲醇转移到50：50甲醇：甲基水杨酸盐;和 4） 步骤 3.7，将试样从 50：50 甲醇转移到整洁的 MS（与 MS 重复 2 倍，如步骤 3.8 所示）。

由于甲基水杨酸会迅速软化聚苯乙烯塑料制品，我们使用带盖玻璃底的阳极氧化铝盘将澄清的生物膜放在倒置显微镜的舞台上。盖玻璃采用UV固化光学水泥（诺兰光学粘合#61，参见材料表）。如果MS在一天结束时被去除，用异丙醇清洗盘子，然后用肥皂水和冲洗，水泥盖玻璃将服务数月。

由于最小化球形畸变的重要性和足够的工作距离，客观透镜选择在澄清标本的大规模成像中至关重要。在这些研究中，我们有三个目标的经验。在倒置显微镜设置中，我们使用长时间工作距离、中等数值孔径 （NA） 目标油浸没在盖玻璃下方，生物膜浸入覆盖玻璃上方的盘中甲基水杨酸盐中。我们的大部分工作都完成了蔡司环球系列非色目标，类型461708，40x 0.85NA Oel 160/1.5，与负160毫米焦距适配器一起使用，用于名义无限偶联（IC）兼容性。这个目标最初设计用于通过1.5毫米显微镜幻灯片，工作距离为0.35毫米的浸没式观察^25。当与标准盖玻璃（0.17 mm）一起使用时，工作距离要大得多：1.5 × 0.35×0.17 = 1.68 mm = 1，680 μm。我们还使用新的蔡司多浸没目标，类型为 420852，25x 0.8NA LD LCI 平面图-同色，工作距离超过 540 μm，浸入校正设置为”油”的高侧。这一目标被高度纠正，并产生一个极好的形象。在直立显微镜支架上，我们使用新的尼康多浸没目标，类型 MRD71120，10x 0.5NA CFI 平面-色谱，工作距离超过 5，000 μm （5 mm），浸入校正设置为”油”的高端（n = 1.518）。虽然这一目标具有低于其他目标的NA，但它具有直接浸入甲基水杨酸盐的优点。

为了在速度和分辨率方面优化数据采集，共聚焦显微镜设置最好应同时满足横向和轴向奈奎斯特采样密度^18。使用传统标准，将共聚焦针孔直径名义上设置为 1 气孔单元。在放大的坐标中，

d_P （μm） = 1.22 x 放大倍数 x （发射波长以 μm 为单位） / NA

横向采样（像素间距）不应超过 （1/2） x Abbe 的分辨率限制。在对象空间坐标中，

[x， μy = （发射波长以 nm） / （4 NA）

轴向采样（对焦增量）不应超过逆轴向带宽，

[z = （浸入指数） x （发射波长以 nm） / （NA²）

共聚焦光学系统将显微镜的带宽扩大，并将横向和轴向分辨率锐化至少 1/⁄2。

对于我们最常使用的 40x 0.85 NA 目标，请参阅表 1了解 600 nm 发射波长的这些公式的结果（Alexa Fluor 594）。

表 1：600 nm 发射波长的共聚焦针孔直径、横向采样和轴向采样值。

使用具有这些设置的旋转磁盘共聚焦扫描仪和 1，392 x 1，040 像素扫描场，可以以合理的速度和分辨率获取来自生物膜标本的数据。典型的单色 3D 图像堆栈运行 0.35*1.55 GB。

澄清介质在广泛使用中跨越了显著的折射率范围。通过暗场照明和目视检查，我们发现固定的C.白化生物膜在n = 1.5上方最透明。通过相位对比显微镜将此细化为 n = 1.530=1.535。出于许多实际原因，我们使用甲基水杨酸盐（n = 1.537）作为最终指数匹配溶剂。虽然溶剂交换会带来试样变形或其他伪影的风险，但固定、澄清的试样中的细胞具有与活试样相似的细胞体尺寸、海噬膜直径和隔膜长度尺寸。

溶剂交换过程中的许多变化是可能的（例如，使用不同的过渡溶剂或不同的最终溶剂）。甲醇因其高极性和快速扩散性而被选中，但乙醇已被证明能更好地保存红色荧光蛋白（RFP）量子产量²⁶作为过渡溶剂。甲基水杨酸盐的指数、中极性、低蒸汽压力以及与许多污渍、染料和荧光蛋白的相容性被选中。然而，指数稍低的最终溶剂，或甲基水杨酸和较低指数溶剂（如丁醇）的混合物，可能效果更好。

出乎意料的是，通过生物膜看出其分层的内部特征的能力，也有助于查看扩展结构的起源，如长，未纠缠的尖峰催眠和侵入性基底海藻在某些子地层。C. 藻化剂中的机会性毒性取决于其遗传多功能性（即，向子宫生长转换、细胞底质和细胞粘附性提高、细胞萌芽和伸长生成渗透物以及使用替代营养素）。海噬性扩展使单个C.白化病细胞从噬菌体免疫细胞中分离，但也是入侵所必需的。生物膜附着力和子宫纠缠似乎提供了催眠剂有效侵入地层所需的表面锚定。当该底层为宿主组织时，可能导致毒性增加。

成像完整的生物膜能够利用记者菌株进行基因表达、模型组织亚地层以及包括天然生物膜中发现的细菌等其他生物体，进行大量信息性实验。即使在最简单的纯结构成像与细胞壁染色的情况下，原位表型被揭示，然后可以量化和基因分析。