ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

הרגולציה ההדוקה של תפקוד החלבון ויציבות היא בעלת חשיבות עליונה, שכן הם מניעים עיקריים של שליטה פנוטיפית בביולוגיה. תפקידו של חלבון בנוי משני מרכיבים: רצף הפוליפפטיד המהותי שלו וכל שינוי פוסט-טרנסלציה (PTMs). זוהו PTMs כימיים שונים כולל גליקוסילציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה¹. בשנת 1975 זיהה גולדשטיין ואח’² חלבון קטן וקרא לו אוביקוויטין בשל אופיו בכל מקום. אוביקוויטין נמצאה חשובה בהשפלת חלבונים³. עם זאת, מאז נקבע כי הפונקציה של ubiquitin כמו מולקולת איתות משתרע הרבה מעבר ויסות יציבות החלבון. איתות Ubiquitin מעורב במגוון רחב של פונקציות ביולוגיות אחרות, כגון ייצוב חלבון, autophagy, בקרת מחזור התא, וסחר בחלבון⁴.

בעוד PTMs אחרים הם בדרך כלל בינארי (כלומר, החלבון משתנה או נשאר ללא שינוי) עבור אתר נתון, ubiquitin יכול לשנות חלבון הן כמונומר או כשרשרת פולימרית, עם ubiquitin המצורף עצמו להיות ubiquitinated. יתר על כן, שרשרת פוליוביקוויטין זו יכולה להתפתח במספר טופולוגיות עם ubiquitination של ubiquitin הקודם הצמדה לאחד משמונה אתרי קישור^5,6. אוביקוויטין מועבר על ידי תהליך אנזימטי רב-שלבי (איור 1) שבו מסוף C של אוביקוויטין מקושר לאחד משבעת שאריות הליצין שלו (K06, K11, K27, K29, K33, K48 או K63) או מסוף N של האוביקוויטין הקודם (המכונה M1 או ubiquitination ליניארי)^5,6. טופולוגיית שרשרת זו היא המפתח לגורל החלבון תחת שינוי. לדוגמה, השינוי בשרשרת מקושרת K48 או K11 מוביל לפגיעה בחלבון שהשתנה בפרוטאזום, בעוד ששרשרת ליניארית נחוצה להפעלת איתות NF-kB. לפיכך, ההפצה היחסית של טופולוגיות שרשרת אלה רלוונטית למגוון רחב של שאלות ביולוגיות.

השימוש בספקטרומטריית מסה (MS) הוא יתרון מיוחד לניתוח טופולוגיית שרשרת אוביקוויטין מכיוון שהוא אינו מסתמך על אינטראקציות מבוססות נוגדנים או מבוססות זיקה^7,8, שרבות מהן ספציפיות מוגבלות ואינן מבדילות בין סוגי השרשרת השונים. אפשרות זיהוי שונה היא שימוש במוטנטים אוביקוויטין מהונדסים גנטית. כאן, ליבין מסוים מוחלף ארגינין, אשר לא יכול לתמוך בשינוי על ידי ubiquitin. חוסר היווצרות שרשרת ubiquitin על חלבון המצע מתפרש לאחר מכן כעדות לטופולוגיה ספציפית⁹.

זיהוי מבוסס MS של חלבונים ubiquitinated מבוסס על העובדה כי C-מסוף של ubiquitin מכיל שאריות ארגינין בתנוחה 74 כי הוא מוכר על ידי טריפסין במהלך ההכנה הפרוטאוליטית של הדגימות לניתוח טרשת נפוצה, הפרדת גליצין כפול C-מסוף. גליגלי (-GG) זה נשאר מחובר לקבוצה ε אמינו של שאריות ליצין של חלבון המצע. עבור ניתוח טופולוגית ubiquitin, השינוי מתרחשת על אחד משבעת שאריות ליצין של אוביקוויטין. פעולה זו יוצרת קבוצה של שבעה פפטידים מרכזיים הנושאים שאריות ליצין שמשתנות על-ידי GG, ספציפיות לכל אחת מהטופולוגיות (איור 2). לדוגמה, עם טופולוגיית K06, ליצין במיקום 6 על רצף חומצות אמינו יהיה מוגן מפני עיכול טריפטי עם -GG שינוי של 114 Da הוסיף ליצין זה.

זיהוי של פפטידים מוגדרים מראש ספציפיים על ידי טרשת נפוצה נקרא פרוטאומיקה ממוקדת, או ליתר דיוק, רכישת פפטיד^{ממוקדת 10}. שתי שיטות פותחו בהתאם לביצועים של ספקטרומטר המסה בשימוש. אלה הם ניטור תגובה נבחר (SRM), המכונה גם ניטור תגובה מרובה (MRM), וניטור תגובה מקבילה (PRM). SRM כרוך בבחירת המעברים המורכבים מהמבשר m/z ומהיון המוצר m/z. לעומת זאת, PRM דורש רק את המבשר m/z. לאחר הבחירה, מתבצעת סריקת סקר מלאה של יוני המוצר. זה יש את היתרון כי אין מבחר של יוני מוצר מתאימים עבור כמויות על ספקטרומטר המסה הספציפי יש צורך לפני המדידה¹¹. הן SRM והן PRM יכולים, בהתאם למכשיר, להיות מתוזמנים. תזמון הוא הנוהג של הקצאת חלון זמן שבמהלכו ייכלל יון מסוים לניתוח, שכן פפטידים מתרוממים בזמני שמירה מוגדרים מהמערכת הכרומטוגרפית. צמצום מספר היונים הנחקרים בכל זמן נתון מגדיל את תדירות החקירה של היונים המתוכננים באותה תקופה, ובכך משפר את דיוק הנתונים.

באופן כללי, היישום של פרוטאומיקה ממוקדת עבור טופולוגיית ubiquitin זהה לכל ניסוי פרוטאומיקה ממוקד אחר. עם זאת, שני הבדלים מרכזיים חשובים: ראשית, יש לשקול את היציבות של שרשראות ubiquitin. ישנם אנזימים deubiquitinating חזק מרובים (DUBs) כי במהירות להשפיל שרשראות על תמוגה התא. הפרוטאסות הספציפיות לאוביקוויטין מתחלקות לשתי קטגוריות, התיאסטרות והמתכות. רוב האוביקוויטין-הידרולאסות הן תיאסטראסים ונושאות שאריות ציסטאין במרכז הפעיל שלהן. על ידי alkylating שאריות ציסטאין זה, הם יכולים להיות מושבתים. ככזה, השימוש במאגרי ייצוב ubiquitin המכילים סוכני alkylating, כמו N-אתילמלימיד (NEM), וכימיקלים denaturing מאוד, ושמירה על דגימות מקורר חיוני לניתוח מוצלח. שנית, שלא כמו ניסויים ממוקדים אחרים, בחירת הפפטיד קבועה. בניסוי ממוקד טיפוסי, ניתן לבחור פפטיד פרוטאוטיפי לביצועים כרומטוגרפיים ויוניזציה טובים. עבור כמה פפטידים אופייניים טופולוגיה כגון K48 מאפיינים אלה טובים, ואילו עבור אחרים, הם פחות רצויים. לדוגמה, כרומטוגרפיה K33 בהגדרה הפוכה טיפוסית היא ירודה בשל היווצרות של פרופיל elution מתוח, ואת תכונות יינון לקוי של פפטיד K27 להפחית את הראות שלה על ידי MS¹².

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבצע הערכה טופולוגית ubiquitin של מדגם ביולוגי על ידי PRM. נתונים לדוגמה עבור ההליך מוצגים באמצעות הפרעה של פרוטאזום באמצעות טיפול מעכב MG-132 במספר סוגי תאים שונים.