القياس الكمي للنض المعدني في الفصل اللوني لتقارب المعادن

منذ إنشائها من قبل Porath وزملاء العمل¹، وقد تحولت اللونية تقارب المعادن (ايماك) وسيله للاختيار لفصل البروتينات بسرعة علي أساس قدرتها علي السندات مع الانتقال أيونات المعادن مثل الزنك^{2 +}، Ni^{2 +}، Cu^{2 +}، وشارك^{2 +}. هذا هو الأكثر شيوعا من خلال العلامات المهندسة بولي-histidine والآن واحده من تقنيات تنقيه الكروماتوغرافي الأكثر شيوعا لعزل البروتينات المؤتلف². وقد وجد ايماك أيضا تطبيقات تتجاوز تنقيه البروتين المؤتلف كوسيلة لعزل الكينولونات ، التتراسيكلين ، امينونوغليكوسيدس ، الماكروليدات ، و β-اكتام لتحليل عينه الغذاء³ وكخطوه في تحديد علامات البروتين مصل الدم لسرطان الكبد والبنكرياس^4،5. ليس من المستغرب, ايماك أصبح أيضا وسيله للاختيار لعزل عدد من الانزيمات طاقة الاصليه^6,7,8,9,10. ومع ذلك ، فان التنفيذ الناجح لأساليب التنقية هذه للدراسات علي البروتينات الحيوية النشطة انزيمي يعتمد علي وجود مستويات تافه من الصفائح المعدنية التي يالم من مصفوفة العمود إلى الشطف وقد عرفت الكاتيونات المعادن ثنائي التكافؤ المستخدمة عاده في ايماك الاهميه البيولوجية باثولوجيك ، حتى في تركيزات منخفضه^11،12. التاثير الفسيولوجي لهذه المعادن هو الأكثر وضوحا في النظم الحيوية ، حيث يمكن ان تكون مميته كمثبطات التنفس الخلوي أو التمثيل الضوئي^13،14،15. وهناك مسائل مماثله لا مفر منها بالنسبة لغالبيه فئات البروتين حيث يمكن ان تتداخل معادن الملوثات المتبقية مع الوظائف البيولوجية للبروتين أو توصيفها بالتقنيات البيوكيميائية والبيوفيزيائية.

في حين ان مستويات التلوث المعدني في ظل الظروف المؤكسدة واستخدام ايميدازول كالتملص هي عاده منخفضه¹⁶، عزل البروتين التي أجريت في وجود عوامل الحد السيستين (dtt ، β-mercaptoethanol ، الخ) أو مع البخاخات اقوي مثل حامض^17،18 أو حمض ايثيلليندياميتاتاتاستيك (أدتا) يؤدي إلى مستويات اعلي بكثير من تلوث المعادن^19،20. المثل ، نظرا لان الأيونات المعدنية في راتنجات IMAC كثيرا ما تنسقها المجموعات الكربوكسيليه ، فان الشوائب البروتينية التي تتم في ظل الظروف الحمضية من المرجح ان يكون لها مستويات اعلي بكثير من التلوث المعدني. ويمكن تقييم المحتوي المعدني في الحلول باستخدام القياس الطيفي للامتصاص الذري (العاص) والبلازما المقترنة بالحث علي الطيف الكتلي (برنامج المقارنات الدولية) وصولا إلى حد الكشف في نطاق ppb-ppt^{21،22،23،24}. ولسوء الحظ ، فان البرنامج والبرنامج ليسا وسيلتين واقعيتين للكشف في مختبر الكيمياء الحيوية التقليدية لان هذه الأساليب تتطلب الحصول علي المعدات المتخصصة والتدريب.

العمل السابق من قبل بريتن^25,26 التحقيق في استخدام هيدروكسينفثول الأزرق (hnb) كوسيلة لتحديد وجود المعادن الانتقالية في الحل. ومع ذلك ، كانت هناك تناقضات داخلية عديده في البيانات²⁰ ولم تقدم تلك الاعمال بروتوكولا ملائما. الدراسات التي قام بها Temel et al.²⁷ و فيريرا وآخرون²⁸ الموسعة علي العمل البرية مع hnb كمؤشر المعادن المحتملة. ومع ذلك ، وضعت Temel بروتوكول الذي يجعل من استخدام العاص لتحليل العينة ، وذلك باستخدام HNB فقط كعامل مخلبيه. وقد استخدمت دراسة فيريرا التغيير في أطياف الامتصاص HNB في 563 نانومتر ، وهي منطقه من أطياف الصبغة الحرة HNB التي تتداخل بشكل كبير مع أطياف المجمعات المعدنية HNB في الأس الهيدروجيني 5.7 ، مما يجعل حساسية الفحص منخفضه إلى حد ما ، فضلا عن الناتجة في ضعف نسبيا تقارب ربط المعادن²⁰. لمعالجه القضايا في المختبر الخاص بنا مع Ni^{2 +} الرشح من ايماك ، قمنا بتوسيع العمل الذي قام به البرية^25،26 و ferreria²⁸ لتطوير اختبار سهله قادره علي الكشف عن مستويات نانومولار العديد من المعادن الانتقالية. وأظهرنا ان HNB يربط النيكل وغيرها من المشتركة للمعادن ايماك مع التقارب النانومولار ملزمه وشكل مجمع 1:1 علي مجموعه واسعه من القيم pH²⁰. ويستند الفحص المذكور هنا إلى هذه النتائج ويستخدم التغيرات الماصة في طيف HNB في 647 نانومتر للقياس الكمي للمعادن. ويمكن اجراء الفحص في نطاق الحموضة الفسيولوجية باستخدام المخازن المؤقتة المشتركة والاجهزه الموجودة في مختبر الكيمياء الحيوية النموذجية باستخدام الكشف عن ألوان والكمية من المعادن صبغ المجمعات والتغيير المرتبطة بها في الامتصاص من صبغ الحرة عندما يربط إلى المعدن.