Quantification du lixiviation des métaux dans la chromatographie d'affinité métallique immobilisée

Depuis sa création par Porath et ses collègues¹, la chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) est devenue une méthode de choix pour séparer rapidement les protéines en fonction de leur capacité à se lier avec des ions métalliques de transition tels que Zn^{2 ,}Ni^{2 ,}Cu², et Co². Ceci est le plus souvent fait par l’intermédiaire des étiquettes de poly-histidine machinées et est maintenant l’une des techniques de purification chromatographique les plus communes pour l’isolement des protéines recombinantes^2. IMAC a également trouvé des applications au-delà de la purification des protéines recombinantes comme un moyen d’isoler les quinolones, tétracyclines, aminoglycosides, macrolides, et les lactams pour l’analyse des échantillons alimentaires³ et comme une étape dans l’identification des marqueurs de protéines du sérum sanguin pour les cancers du foie et du pancréas^4,5. Sans surprise, IMAC est également devenu une méthode de choix pour l’isolement d’un certain nombre d’enzymes bioénergétiques indigènes^6,7,8,9,10. Cependant, la mise en œuvre réussie de ces méthodes de purification pour des études sur les protéines bioénergétiques enzymatiquement actives dépend de la présence de niveaux négligeables de cations métalliques lixiviées de la matrice de colonne dans l’éluate. Les cations métalliques divalentes couramment utilisées dans l’IMAC ont connu une signification biologique pathologique, même à de faibles concentrations^11,12. L’effet physiologique de ces métaux est plus prononcé dans les systèmes bioénergétiques, où ils peuvent s’avérer mortels comme inhibiteurs de la respiration cellulaire ou de la photosynthèse^13,14,15. Des problèmes similaires sont inévitables pour la majorité des classes de protéines où les métaux résiduels contaminants peuvent interférer avec les fonctions biologiques d’une protéine ou la caractérisation avec des techniques biochimiques et biophysiques.

Alors que les niveaux de contamination des métaux dans des conditions oxydantes et en utilisant l’imidazole comme éluant sont généralement faibles¹⁶, les isolements protéiques effectués en présence d’agents de réduction de la cystéine (TNT, mercaptoéthanol, etc) ou avec des chélateurs plus forts comme l’histidine^17,18 ou l’acide éthylediaminetetraacetic (EDTA) se traduisent par des niveaux beaucoup plus élevés de contamination métallique^19,20. De même, puisque les ions métalliques dans les résines IMAC sont fréquemment coordonnés par des groupes carboxyliques, les élutions protéiques effectuées dans des conditions acides sont également susceptibles d’avoir des niveaux beaucoup plus élevés de contamination des métaux. La teneur en métaux dans les solutions peut être évaluée à l’aide de la spectroscopie d’absorption atomique (AAS) et de la spectrométrie de masse plasmatique couplée inductive (ICP-MS) jusqu’à une limite de détection dans la gamme ppb-ppt^21,22,23,24. Malheureusement, l’AAS et l’ICP-MS ne sont pas des moyens réalistes de détection dans un laboratoire de biochimie traditionnel, car ces méthodes nécessiteraient l’accès à de l’équipement spécialisé et à la formation.

Les travaux antérieurs de Brittain^25,26 ont étudié l’utilisation du bleu hydroxynaphthol (HNB) comme un moyen d’identifier la présence de métaux de transition dans la solution. Cependant, il y avait plusieurs contradictions internes dans les données²⁰ et ces travaux n’offrait pas un protocole adéquat. Des études de Temel et coll.²⁷ et Ferreira et^{coll. 28} ont porté sur le travail de Brittain avec HNB en tant qu’indicateur métallique potentiel. Cependant, Temel a développé un protocole qui utilise aAS pour l’analyse de l’échantillon, en utilisant HNB seulement comme un agent de chélage. L’étude de Ferreira a utilisé le changement des spectres d’absorption de HNB à 563 nm, une région des spectres HNB à colorant libre qui chevauche fortement les spectres des complexes hNB-métal au pH 5.7, ce qui rend la sensibilité d’analyse assez faible et a entraîné une affinité de liaison métallique relativement faible²⁰. Pour résoudre les problèmes dans notre propre laboratoire avec Ni 2 ‘lixiviation de l’IMAC, nous avons élargi le travail effectué par Brittain^{25, 26} et Ferreria²⁸ pour développer un test facile capable de détecter les niveaux de nanomolar de plusieurs métaux de transition. Nous avons montré que HNB lie le nickel et d’autres métaux communs pour IMAC avec des affinités de liaison sous-nanomolaires et la forme 1:1 complexe sur un large éventail de valeurs de pH²⁰. L’analyse rapportée ici est basée sur ces résultats et utilise des changements d’absorption dans le spectre HNB à 647 nm pour la quantification des métaux. L’analyse peut être effectuée dans la plage de pH physiologique à l’aide de tampons et d’instruments communs trouvés dans un laboratoire de biochimie typique en utilisant la détection colorimétrique et la quantification des complexes de teinture métallique et le changement associé dans l’absorption du colorant libre lorsqu’il se lie au métal.