Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional
Summary
O presente manuscrito detalha como isolar as artérias hipocampais e capilares do cérebro do rato e como pressioná-las para a miografia de pressão, imunofluorescência, bioquímica e estudos moleculares.
Abstract
De alterações comportamentais sutis à demência em estágio avançado, o comprometimento cognitivo vascular geralmente se desenvolve após a isquemia cerebral. Acidente vascular cerebral e parada cardíaca são doenças extremamente sexualmente dimórficas, e ambos induzem isquemia cerebral. No entanto, o progresso na compreensão do comprometimento cognitivo vascular e, em seguida, o desenvolvimento de tratamentos específicos para o sexo, tem sido parcialmente limitado por desafios na investigação da microcirculação cerebral de modelos de camundongos em estudos funcionais. Aqui, apresentamos uma abordagem para examinar a sinalização capilar-a-arteriole em uma preparação de arteriole capilar-parenchymal hipvivo (HiCaPA) do cérebro do rato. Descrevemos como isolar, cannuar e pressurizar a microcirculação para medir o diâmetro arteriolar em resposta à estimulação capilar. Mostramos quais controles funcionais apropriados podem ser usados para validar a integridade de preparação hicapa e exibir resultados típicos, incluindo testar o potássio como um agente de acoplamento neurovascular e o efeito do inibidor recentemente caracterizado da família do canal de potássio retificada kir2, ML133. Além disso, comparamos as respostas nos preparativos obtidos de camundongos machos e fêmeas. Embora esses dados reflitam investigações funcionais, nossa abordagem também pode ser usada em biologia molecular, imunoquímica e estudos de eletrofisiologia.
Introduction
A circulação pial na superfície do cérebro tem sido objeto de muito estudo, em parte por causa de sua acessibilidade experimental. No entanto, a topologia da vasculatura cerebral cria regiões distintas. Em contraste com a robusta rede pial rica em anastomoisés com capacidade substancial para redirecionar o fluxo sanguíneo, as artérias parenchymal intracerebrais (PAs) apresentam fornecimento colateral limitado, cada um deles perfusando um volume discreto de tecido nervoso1,2. Isso cria um efeito de gargalo sobre o fluxo sanguíneo que, combinado com características fisiológicas únicas3,4,5,6,7,8, faz das artérias intracerebrais um local crucial para o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) regulamento9,10. Apesar dos desafios técnicos inerentes ao isolamento e à cannulação das As, a última década tem visto um aumento do interesse em estudos funcionais ex vivo usando embarcações pressurizadas11,12,14,15,16, 17. Uma das razões para esse aumento do interesse é o considerável esforço de pesquisa realizado sobre o acoplamento neurovascular (NVC), o mecanismo que sustenta a hiperemia funcional cerebral18.
Regionalmente, a CBF pode aumentar rapidamente após a ativação neural local19. Os mecanismos celulares e as propriedades de sinalização que controlam o NVC são incompletamente compreendidos. No entanto, identificamos um papel previamente inesperado para os capilares cerebrais durante o NVC na detecção de atividade neural e traduzi-lo em um sinal elétrico hiperpolarizante para dilatar artérias a montante20,21,22. Os potenciais de ação23,24 e a abertura dos canais K+ (BK) ativados por grande conduta Ca2+(BK) nos pés arrumados ascíticos25,26 aumentam a concentração interstitial de íons de potássio [K+]o, o que resulta na ativação de canais retrógrados fortes K+ (Kir) no endotelium vascular dos capilares. Este canal é ativado por Kexterno + mas também pela própria hiperpolarização. Espalhando-se através de junções gap, a corrente hiperpolarizadora, em seguida, regenera em células endotélias capilares adjacentes até a arteriole, onde causa relaxamento miócito e aumento cbf20,21. O estudo deste mecanismo nos levou a desenvolver uma preparação pressurizada de arteriole capilar-parenchymal (CaPA) para medir o diâmetro arteriolar durante a estimulação capilar com agentes vasoativos. A preparação do CaPA é composta por um segmento de arteriole intracerebral cannulado com uma ramificação capilar intacta a jusante. As extremidades capilares são comprimidas contra o fundo de vidro de câmara por uma micropipette, o que oclude e estabiliza toda a formação vascular20,21.
Anteriormente fizemos inovações instrumentais por imagem capa preparações do córtex do rato20,21 e arterioles da amígdala de rato13 e hipocampo16,17. Como a vasculatura hipocampal recebe mais atenção devido à sua suscetibilidade a condições patológicas, aqui fornecemos um método passo a passo para a preparação da CaPA do hipocampo do camundongo (HiCaPA) que não só pode ser usado em estudos funcionais de NVC, mas também em biologia molecular, imunoquímica e eletrofisiologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
A preparação pressurizada hicapa (hipocampal capilar-parenchymal arteriole) descrita no presente manuscrito é uma extensão do nosso procedimento bem estabelecido para isolar, pressurizar e estudar as artérias parenchymal29. Recentemente, relatou que os canais Kir2.1 em células endotélias capilares cerebrais sentido aumenta em [K+]o associado com a ativação neural, e gerar um sinal hiperpolarizante ascendente que dilata artérias rioacima 20. R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Jules Morin por comentários perspicazes sobre o manuscrito. Esta pesquisa foi financiada por prêmios da organização sem fins lucrativos CADASIL Together We Have Hope, do Center for Women’s Health and Research e do NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
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