스트레스 치료하에 세균 성장의 다단계 분석

1. 세포 배양, 스트레스 유도 및 샘플링 절차 참고: 배경 입자를 방지하기 위해 0.22 μm에서 여과된 멸균 배양 유리 제품, 파이펫 팁 및 성장 매체를 사용합니다. 여기서, 세포 배양은 낮은 자가형광 풍부 정의 배지에서 성장한다(자료표참조)7,8. 루리아-브롬(LB) 아가로즈 플레이트(필요한 경우 선택적 항생제)에 얼어붙은 글리세롤 스톡으로부터 관심균균을 줄무늬를 하고 밤새 37°C(17시간)에서 배양한다.참고: 여기에 제시된 예제 실험은 대장균 MG1655 hupA-mCherry를 사용합니다. 이 균주는 HU 뉴클레오이드 관련 단백질의 형광 태그가 붙은 소단위 α를 생성하여 살아있는 세포에서 염색체의 광 현미경 시각화를허용합니다 9. 단일 콜로니로 배지의 5 mL을 접종하고 37°C에서 성장시키고 분당 140회 회전(rpm)에서 하룻밤(17시간)까지 흔들어 서 있다. 플라스크 (≥50 mL) 또는 큰 직경 (≥2 cm) 시험관은 교반 배양의 만족스러운 폭기를 보장하기 위해 사용되어야합니다. 다음날 아침 600 nm(OD600nm)에서광학 밀도를 측정하고 0.01의 OD600nm에 신선한 배지를 포함하는 시험관으로 배양을 희석한다. 배양물의 총 부피는 실험 중에 분석할 시간 점의 수에 따라 조정되어야 합니다. 배양된 200 μL 샘플을 마이크로플레이트(작업량당 0.2 mL)에 적재하고 37°C에서 배양 시 OD600nm 모니터링을 위해 자동 플레이트 판독기(재료 표참조)에 놓습니다. 37°C에서 접종된 시험관을 OD600nm =0.2로 흔들어, 풍부한 배지에서의 전체 지수상에 대응하여 배양한다.참고: 적절한 지수 성장을 달성하기 전에 적어도 4-5 세대 동안 세포를 성장시키는 것이 중요합니다. 단계 1.3 (OD600nm = 0.01)에서 사용되는 초기 접종은 가난한 매체에서 성장의 경우 (즉, 지수 상이 OD 0.2 이하에 도달하는 경우) 또는 더 많은 세대가 원할 경우 (예를 들어, 특정 생리 학적 연구 또는 확장 된 스트레스 치료에) 적응될 필요가 있다. OD600nm = 0.2에서, t0 시간 점 (응력 유도 전에 기하급수적으로 성장하는 세포)에 해당하는 다음 배양 샘플을 취하십시오): (1) 시간 경과 현미경 이미징을 위해 미세 유체 장치에 즉시 적재되는 150 μL 샘플(섹션 2 참조); (2) 희석 및 도금 분석법(섹션 3 참조)을 위한 200 μL 샘플; (3) 유세포분석용 얼음에 넣을 250 μL 샘플(섹션 4); (4) 현미경 스냅샷 이미징을 위해 아가로오스 장착 슬라이드에 즉시 증착되는 10 μL 샘플(섹션 5 참조). 시험관에 남아 있는 세포 배양을 37°C에서 교배하여 조사하고 자양분하고자 하는 특정 스트레스 치료에 140 rpm(140 rpm)을 노출시다.참고: OD600nm 모니터링을 위한 자동 플레이트 리더에서 성장하는 배양도 스트레스 처리를 받아야 한다. 응력 치료 후 관련 시점(t1,t2,t3등)에서, 응력 배양으로부터 다음세포 샘플을 취한다: (1) 희석 및 도금 분석(섹션 2 참조)에 대한 200 μL 샘플; (2) 유세포분석용 얼음에 넣은 250 μL 시료(섹션 3); (4) 현미경 스냅샷 이미징을 위해 아가로오스 장착 슬라이드에 즉시 증착되는 10 μL 샘플(섹션 4 참조).참고: 각 스트레스 유발 치료는 용량과 시간에 따라 달라지는 효율성을 가지고 있습니다. 따라서, 최적의 결과 대 한 사용 하는 치료의 복용량 및 기간을 결정 하기 위해 예비 테스트를 실행 해야 할 수 있습니다. 이는 다양한 용량 및 노출 시간으로 처리된 세포 배양물의 자동 플레이트 리더(잠재적으로 도금 검문과 관련된)를 사용하여 OD 모니터링을 수행함으로써 수행될 수 있다. 여기에 제시된 실험에서, 세포 배양은 세포 분열을 억제하는 항생제 세팔렉신(Ceph.)을 60분 동안 5 μg/mL 최종 농도에서 처리한 후, 15 mL 튜브에서 세포를 펠렛하여 원심분리(475 g, 5 분)를 사용하여, 상체를 제거하고, 깨끗한 배지에 의해 세포 펠릿을 동일한 부피로 재중단시키고, 깨끗한 튜브로 동일한 부피로 세포 펠릿을 재중단시켰다. 세척된 세포를 37°C에서 교반(140 rpm)하여 배양하여 회수할 수 있도록 하였다. 샘플을 t 60(세팔렉신-60분 처리된’ 샘플에 상응하는 세팔렉신 첨가 후 60분), t120(세척 후 60분), 및 t 180(세척 후 120분)에서 채취하였다. 2. 도금 분석 참고: 도금 분석법은 배양 샘플에서 CFU를 생성할 수 있는 세포의 농도를 측정할 수 있게 한다. 이 절차는 1개의 세포가 2개의 실행 가능한 세포로 분할하고 세포 분열 체포를 검출하는 것을 허용하는 비율을 제시합니다 (예를 들면, 세포 용해의 세균 생성 시간의 증가). 신선한 배지에서 배양 시료 200 μL 중 최대10배-7개의 직렬 희석을 준비합니다. 플레이트 100 μL은 37°C에서 하룻밤 배양 후 3−300 콜로니 사이에서 수득하기 위해 비선택적 LB 아가로즈 플레이트상에 적절한 희석을 하였다.참고: 박테리아 분열을 제한하기 위해 신선한 배지의 직렬 희석을 신속하게 수행해야 합니다. 또는, 연구원은 희석 과정 도중 세포 분열을 방지하기 위하여 탄소 근원 없이 식염수 해결책을 사용하는 것을 고려할 수 있습니다. 다음 날, 각 배양 샘플에서 생존 가능한 세포 (CFU / mL)의 농도를 결정하기 위해 콜로니의 수를 계산합니다. CFU/mL을 치료되지 않은 세포 배양에 대한 시간 함수로 플로팅합니다. 3. 유세포분석 참고: 다음 섹션에서는 유세포 분석분석을 위한 세포 샘플의 제조에 대해 설명합니다. 이 분석 기술은 많은 수의 세포에 대한 세포 크기 및 DNA 함량의 분포를 보여줍니다. 가능하면 유세포분석 샘플을 즉시 처리하는 것이 좋습니다. 또는, 시료는 얼음에 보관될 수 있습니다 (최대 6 시간) 하루의 끝에 동시에 분석, 일단 도금 및 현미경 이미징이 수행되었습니다. 배양 시료의 250 μL을 희석하여 4°C에서 신선한 배지에서 ~15,000 세포/μL(OD600nm~0.06)의 농도에서 250 μL을 얻었다.참고 : 얼음에 배양세포의 성장과 형태 학적 변형을 제한합니다. 양자택일로, 사용자는 일반적으로 유세포 분석10을위해 추천되는 대로 75% 에탄올에 있는 세포의 고정을 능력을 발휘하는 것을 고려할 수 있습니다. DNA 염색을 위해, 세균 샘플을 DNA 형광 염료(비율 1:1)의 10 μg/mL 용액과 혼합하고 샘플을 분석하기 전에 15분 동안 어둠 속에서 배양합니다. ~120,000 셀 / 분 유량으로 유량 세포계에 샘플을 전달합니다. 적절한 설정으로 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 광뿐만 아니라 DNA 형광 염료 형광 신호(FL-1)를 획득합니다. FSC 및 FL-1 세포 밀도 히스토그램을 플롯하여 세포 집단에서 세포 크기 및 DNA 함량의 분포를 나타낸다. 4. 스냅샷 현미경 이미징 참고: 다음 부분에서는 집단 스냅샷 분석을 위한 현미경 슬라이드 및 이미지 수집의 준비에 대해 설명합니다. 이 절차는 세포의 형태에 관한 정보를 제공 할 것입니다 (세포 길이, 폭, 모양) 핵 DNA의 세포 내 조직. 온도가 37°C에서 열전성 현미경 챔버를 예열하여 관찰을 시작하기 전에 온도를 안정화합니다. 이 챔버는 시간 경과 실험 동안 현미경 광학 및 샘플 단계의 온도 변조를 허용합니다. 레스터린과 뒤배리7에설명된 대로 아가로즈 장착 슬라이드를 준비한다. 파란색 프레임 의 하단에서 플라스틱 필름을 제거합니다(재료 표참조) 빈 플라스틱 필름을 다른 쪽에 둡니다. 현미경 유리 슬라이드에 파란색 프레임을 붙입니다. 피펫 ~ 150 μL의 용융 1% 아가로즈 중간 용액및 블루 프레임 구획 내에서 부어. 깨끗한 커버슬립으로 빠르게 덮어 여분의 액체를 제거하고 아가로즈 패드가 실온에서 고형화될 때까지 몇 분 동안 기다립니다. 셀 샘플이 준비되면 커버슬립과 플라스틱 필름을 파란색 프레임에서 제거합니다. 아가로즈 패드에 10 μL의 세포 샘플을 붓고 유리 슬라이드를 부드럽게 기울여 액적을 퍼뜨립니다. 모든 액체가 흡착되면 파란색 프레임에 깨끗한 커버 슬립을 붙이면 샘플을 밀봉하십시오. 현미경 슬라이드는 이제 현미경 검사법에 대 한 준비가. 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓고 투과 된 빛 (위상 대비 목표)과 적절한 파장 (mCherry의 경우 560 nm)에서 광원 여기를 사용하여 이미지 수집을 수행합니다. 이미지 분석 중에 자동화된 셀 감지를 용이하게 하기 위해 격리된 셀을 포함하는 뷰 필드를 선택합니다. 세포 집단의 강력한 통계 분석을 허용하기 위해 적어도 300개의 셀이 이미지화되어 있는지 확인합니다. 5. 마이크로 유체 학적 시간 경과 현미경 이미징 참고: 다음 부분에서는 미세 유체 플레이트(재료 표참조), 셀 로딩, 미세 유체 학적 프로그램 및 시간 경과 이미지 수집의 준비에 대해 설명합니다. 이 화상 진찰 절차는 실시간으로 개별 적인 세포의 행동을 제시합니다. 미세 유체 플레이트에서 보존 용액을 제거하고 미세 유체 소프트웨어 사용자 가이드에 설명된 대로 37°C로 예열된 신선한 매체로 교체합니다. 미세 유체 플레이트를 매니폴드 시스템에 밀봉하고 프라이밍 버튼을 클릭합니다. 현미경 단계에 매니 폴드 시스템과 미세 유체 플레이트를 놓고 현미경 수집을 시작하기 전에 ~ 2 시간 동안 37 °C에서 예열하십시오.참고: 이 예열 단계는 시간 경과 실험 도중 현미경의 초점을 변경하고 화상 취득을 손상하는 미세 유체 챔버의 팽창을 피하기 위하여 중요합니다. 미세 유체 플레이트를 밀봉합니다. 배지를 웰 8에서 150 μL의 배양 샘플로 교체하고 응력 유도 시약의 유무에 관계없이 원하는 배지로 1에서 5까지의 배지를 대체합니다. 미세 유체 플레이트를 밀봉하여 현미경 단계에 놓습니다. 미세 유체 소프트웨어(재료 표참조)에서 셀 로딩 절차를 실행합니다. 세포의 로딩이 투과된 빛의 현미경 아래를 보면서 만족스러운지 확인합니다. 챔버 내의 셀 밀도가 충분하지 않은 경우 셀 로딩 절차를 두 번째로 실행합니다. 투과된 광 모드에서 신중하게 초점을 맞추고 고립된 박테리아를 보여주는 여러 시야를 선택합니다. 시간이 지남에 따라 단리된 세포의 성장을 모니터링할 수 있도록 혼잡하지 않은 필드를 선택하는 것이 중요합니다(100 μm2당 ~10-20 셀 권장). 이것은 또한 심상 분석 도중 세포 탐지를 용이하게 할 것입니다. 미세 유체 소프트웨어에서 프로토콜 만들기 단추를 클릭합니다. 세포가 적응할 수 있도록 1-2 생성 시간 등가물용 성장 배지의 주입을 프로그래밍합니다(선택 사항). 그런 다음 2 psi에서 10 분 동안 스트레스 유발 배지를 주입한 다음 스트레스 치료의 원하는 지속 기간 동안 1 psi에서 주사합니다. 스트레스 후 세포의 회복을 분석하려는 경우, 원하는 기간 동안 신선한 성장 배지의 주입을 프로그래밍하십시오.참고: 여기에 제시된 실험에서, 세팔렉신은 2psi에서 10분 동안 주입되었고, 그 다음에 1psi에서 50분이 뒤따랐다. 이어서, 신선한 성장 배지를 10분 동안 2psi로 주입하고, 그 다음에 3시간 1psi로 주입하였다. 전송된 빛의 위상 대비를 사용하여 10분마다 1프레임씩 타임랩스 모드에서 현미경 이미징을 수행하고 필요한 경우 mCherry 신호에 대한 560nm 여기 광원을 사용하십시오.참고: 미세 유체 주입 프로토콜의 시작과 동시에 현미경 이미지 수집을 시작하는 것이 중요합니다. 6. 이미지 분석 참고: 이 섹션에서는 스냅샷 및 타임랩스 현미경 이미지의 처리 및 분석의 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 현미경 이미지의 개폐 및 시각화는 오픈 소스 ImageJ /피지 (https://fiji.sc/)11로수행됩니다. 정량적 이미지 분석은 무료 미생물 플러그인12 (https://microbej.com)와 함께 오픈 소스 ImageJ / 피지 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜은 MicrobeJ 5.13I 버전을 사용합니다. 피지 소프트웨어와 MicrobeJ 플러그인을 엽니다. 스냅샷 분석을 위해 하나의 현미경 슬라이드(샘플 1개)에 해당하는 모든 이미지를 MicrobeJ 로딩 막대에 놓아 이미지를 연결하고 획득한 이미지 스택 파일을 저장합니다. 시간 경과 데이터의 경우 이미지 스택을 MicrobeJ의 로딩 막대에 놓기만 하면 됩니다. 위상 대비 이미지의 세분화에 기초하여 세포의 윤곽을 자동 검출하고, 관련이 있는 경우, 염색된 DNA 형광 신호의 세분화에 기초한 핵형성의. 세포 검출의 정확도를 시각적으로 확인하고 필요한 경우 수정을 위해 MicrobeJ 편집 도구를 사용합니다. 가져온 결과 파일을 저장합니다.참고: 대장균 세포 검출에 사용되는 설정은 재료 표에 표시됩니다(MicrobeJ의 주석/설명 열 참조). 다른 세균 종(특히 막대 모양이 아닌 박테리아의 경우)의 경우 사용자는 감지하기 전에 설정을 구체화해야 합니다(MicrobeJ 자습서 참조). 시간 경과 이미지의 경우, MicrobeJ 편집 도구를 사용하여 세포의 반자동 검출을 실행하는 것이 개별 세포의 운명에 초점을 맞출 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있습니다(MicrobeJ 자습서 참조). 결과를 클릭하여 분석을 완료하고 ResultJ 창을 가져옵니다. 이 시점에서 다양한 유형의 출력 그래프를 생성할 수 있습니다. 세포 모양/길이및 세포당 평균 핵수의 정규화된 히스토그램을 플로팅합니다.