רב היקף ניתוח של צמיחה חיידקים תחת טיפולי סטרס

1. תרבית תאים, השראה והליכי דגימה הערה: השתמש בכלי זכוכית סטרילי לתרבות, בעצות הפיפטה ובמדיום הגדילה שסוננו ב-0.22 יקרומטר כדי להימנע מחלקיקים ברקע. כאן, תרביות תאים מגודלים בינונית נמוכה מוגדרת מדיום עשיר (ראה טבלת חומרים)7,8. פס את הלחץ החיידקי של עניין מתוך מלאי גליצרול קפוא על לוריא ציר (LB) הצלחת (עם אנטיביוטיקה סלקטיבית אם נדרש) ו דגירה ב 37 ° c לילה (17 h).הערה: הניסוי לדוגמה המוצג כאן משתמש es, coli MG1655 Hupa-mcherry. זן זה מייצר את מתויג באופן פלואורויחידות יחידת α של חלבון הקשורים HU נוקלאואיד, ובכך לאפשר הדמיה מיקרוסקופ אור של כרומוזום בתאים חיים9. איחסן 5 מ ל בינוני עם מושבה אחת וגדל ב 37 ° c עם טלטול ב 140 סיבוב לדקה (rpm) לילה (17 h). מבחנות (≥ 50 mL) או קוטר גדול (≥ 2 ס מ) צינורות בדיקה יש להשתמש כדי להבטיח מתכלה משביע רצון של התרבות הנסערת. למחרת בבוקר למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600nm) ולדלל את התרבות לתוך צינור מבחן המכיל מדיום טרי ל-OD600nm של 0.01. הנפח הכולל של התרבות צריך להיות מותאם בהתאם למספר נקודות הזמן שנותחו במהלך הניסוי. לטעון מדגם μL 200 של התרבות לתוך מיקרופלייט (0.2 mL לכל טוב של נפח עבודה עם תחתון שקוף ברור) ולמקם אותו בקורא לוחית אוטומטית (ראה טבלת חומרים) עבור OD מעקב600nm במהלך הדגירה ב 37 ° c. מודדקת את צינור הבדיקה מחוסן ב 37 ° צ’ עם טלטול (140 rpm) כדי OD600nm = 0.2, המתאים שלב מעריכי מלא במדיום עשיר.הערה: חשוב לגדל את התאים לפחות 4-5 דורות לפני השגת הצמיחה האקספוננציאלית המתאימה. הנרשת הראשונית המשמשת בשלב 1.3 (OD600nm = 0.01) צריכה להיות מותאמת במקרה של צמיחה במדיום העני (כלומר, כאשר השלב האקספוננציאלי הוא הגיע מתחת OD 0.2), או אם עוד דורות מבוקשים (למשל, עבור מחקרים פיזיולוגיים ספציפיים או לטיפולים מורחבים הלחץ). ב-OD600nm = 0.2, קחו את דגימות התרבות הבאות המתאימות לנקודת הזמן t0 (תאים הגדלים באופן מעריכי לפני אינדוקציה לחץ): (1) מדגם μl 150 שייטען באופן מיידי במנגנון המיקרו-פלואידיג להדמיה מיקרוסקופית (ראה סעיף 2); (2) דוגמה 200 μL עבור הדילול והציפוי (ראה סעיף 3); (3) המדגם 250 μL לשים על הקרח עבור הניתוח cy, מנסה לזרום (סעיף 4); (4) דוגמת 10 μL שהופקדה מיד על שקופית שנטענה על-ידי הדמיה של תמונת מיקרוסקופ (ראה סעיף 5). לחשוף את תרבות התא שנותר במבחנה לטיפול הלחץ הספציפי שאתה רוצה לחקור את הדגירה ב 37 ° c עם טלטול (140 rpm).הערה: התרבות הצומחת בקורא לוחית אוטומטי עבור ניטור OD600nm צריך גם להיות נתון לטיפול בלחץ. בנקודות הזמן הרלוונטיות לאחר הטיפול בלחץ (t1, t2, t3, וכו ‘), לקחת את דגימות התא הבאות מן התרבות הדגיש: (1) מדגם 200 μl עבור הדילול והציפוי (ראה סעיף 2); (2) דוגמה 250 μL לשים על הקרח עבור הניתוח cy, מנסה לזרום (סעיף 3); (4) דוגמת 10 μL שהופקדה מיד על שקופית שנטענה על-ידי הדמיה של תמונת מיקרוסקופ (ראה סעיף 4).הערה: לכל טיפול הגורם למתחים יש יעילות המהווה מינון ותלות בזמן. לכן, ייתכן שיהיה צורך להריץ בדיקות ראשוניות כדי לקבוע את המינון ואת משך הטיפול שישמשו לקבלת תוצאות אופטימליות. ניתן לעשות זאת על-ידי ביצוע ניטור OD באמצעות קורא לוחית אוטומטי (העלול להיות משויך עם ציפוי שאומר) של תרבות התא שטופלו עם מגוון של מינונים וזמני חשיפה. בניסוי המוצג כאן, התרבות התאית טופלה עם החטיבה התא-מעכב אנטיביוטיקה cephalexin (.) בריכוז 5 μg/mL עבור 60 דקות. Cephalexin היה לאחר מכן שטף את התאים על-ידי שפופרת של 15 מ ל באמצעות צנטריפוגה (475 g, 5 דקות), הסרת supernatant, להשעות את הגלולה התא בנפח שווה של מדיום טרי על ידי ליטוף עדין, והעברת לתוך צינור נקי. התאים שנשטפו היו מודבטים ב 37 ° צ’ עם טלטול (140 rpm) כדי לאפשר התאוששות. המדגם נלקח ב t60 (60 דקות לאחר התוספת cephalexin המתאים “cephalexin-60min-שטופלו” מדגם), t120 (60 דקות לאחר הכביסה), ו t180 (120 דקות לאחר הכביסה). 2. שיטת הציפוי הערה: שיטת הציפוי מאפשרת למדוד את ריכוז התאים המסוגלים ליצור CFU בדגימות התרבות. הליך זה חושף את הקצב שבו תא אחד מתחלק לשני תאים קיימא ומאפשר לזהות מעצרים חלוקת תאים (למשל, להגדיל את הזמן דור חיידקי של פירוק התא). הכינו דילול טורי של 10 מקפלים עד 10-7 של 200 μl של דגימת התרבות במדיום טרי. צלחת 100 μL של הדילול המתאים על לוחות LB שאינם סלקטיבית כדי להשיג בין 3 ל 300 מושבות לאחר הדגירה הלילה ב 37 ° c.הערה: הדילול הסדרתי במדיום הצח חייב להתבצע במהירות כדי להגביל את החלוקה החיידקית. לחילופין, החוקרים עשויים לשקול שימוש בתמיסה מלוחים ללא מקור פחמן כדי למנוע חלוקת תאים במהלך תהליך הדילול. למחרת, לספור את מספר המושבות כדי לקבוע את הריכוז של תאים קיימא (CFU/mL) בכל דגימת תרבות. העלילה CFU/mL כפונקציה של זמן עבור תרבויות תאים מטופל ומטופל. 3. הזרמה הסיטרין הערה: הסעיף הבא מתאר את הכנת דגימות התא לניתוח cy, לצורך זרימה. טכניקת ניתוח זו חושפת את התפלגות גודל התא ותוכן ה-DNA עבור מספר רב של תאים. במידת האפשר, מומלץ לעבד באופן מיידי את הדגימות של הסיילנסה הזורמים. לחילופין, ניתן לשמור דגימות על הקרח (עד 6 שעות) ומנותח בו זמנית בסוף היום, לאחר שנערכו הדמיה של הציפוי והמיקרוסקופיה. לדלל את 250 μL של דגימת התרבות כדי להשיג 250 μL בריכוז של ~ 15,000 תאים/μL (מתאים OD600nm ~ 0.06) במדיום טרי ב 4 ° c.הערה: דגירה על הקרח תגביל את הצמיחה ואת שינוי מורפולוגית של התאים. לחילופין, המשתמש עשוי לשקול ביצוע קיבעון של התאים ב-75% אתנול, כפי שמומלץ בדרך כלל עבור הזרימה cy, try10. עבור כתמים DNA, לערבב את המדגם חיידקי עם 10 μg/mL פתרון של צבע פלורסנט DNA (יחס 1:1) ו דגירה בחושך עבור 15 דקות לפני ניתוח המדגם. להעביר את המדגם לתוך cytometer זרם עם ~ 120,000 תאים/דקה קצב הזרימה. רוכשים אור לפני הזריחה (FSC) ומפוזרים בצד (מתחת לפני המטה) כמו גם האות הפלואורסצנטית DNA לצבוע (FL-1) עם ההגדרות המתאימות. התווה את צפיפות התאים FSC ו-FL-1 לייצוג התפלגות גודל התא ותוכן ה-DNA באוכלוסיית התאים. 4. הדמיה מיקרוסקופית הבזק הערה: החלק הבא מתאר את הכנת שקופיות מיקרוסקופ ורכישת תמונות לניתוח של תצלומי אוכלוסייה. הליך זה יספק מידע אודות מורפולוגיה של התאים (אורך התא, רוחב, צורה) ואת הארגון תאיים של ה-DNA נוקלאואיד. מחממים את תא המיקרוסקופ התרמי ב-37 ° c כדי לייצב את הטמפרטורה לפני תחילת התצפיות. תא זה מאפשר אפנון טמפרטורה של המיקרוסקופ אופטיקה ולדגום שלב במהלך ניסויים לשגות זמן. הכינו את השקופיות הטעונות כמתואר בלסטרלין ובדוברי7. הסירו את הסרט הפלסטי מהחלק התחתון של המסגרת הכחולה (ראו טבלת חומרים) והשאירו את הסרט הפלסטי החלול בצד השני. לתקוע את המסגרת הכחולה על שקופית זכוכית מיקרוסקופ. פיפטה ~ 150 μL של מומסת 1% הפתרון הבינוני ויוצקים בתוך תא המסגרת הכחולה. לכסות במהירות עם שמיכות נקי כדי להסיר את עודפי הנוזלים ולחכות כמה דקות עבור משטח agarose כדי לגבש בטמפרטורת החדר. כאשר דגימת התא מוכנה, הסר את הכיסויים ואת הסרט הפלסטי מהמסגרת הכחולה. יוצקים 10 μL של דגימת תאים על כרית agarose להטות את השקופית זכוכית בעדינות כדי להפיץ את ה-droplet. כאשר כל הנוזל כבר adsorbed, לתקוע שמיכות נקי על המסגרת הכחולה כדי לאטום את המדגם. שקופית המיקרוסקופיה. מוכנה כעת למיקרוסקופ מניחים את השקופית על הבמה במיקרוסקופ ולבצע רכישת תמונה באמצעות אור המשודר (עם מטרת ניגודיות שלב) עם עירור מקור אור באורכי גל המתאים (560 nm עבור mCherry). בחר שדות תצוגה המכילים תאים מבודדים כדי להקל על זיהוי תאים אוטומטי במהלך ניתוח תמונה. ודא כי לפחות 300 תאים מתתמים כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי יציב של אוכלוסיית התא. 5. מיקרופלואידיקה-זמן לשגות הדמיה מיקרוסקופית הערה: החלק הבא מסביר את הכנת לוחיות המיקרו-פלואידיג (ראה טבלת חומרים), טעינת תאים, תוכנית microfluidic ורכישת תמונות בזמן. הליך דימות זה חושף את אופן הפעולה של תאים בודדים בזמן אמת. הסירו את פתרון השימור מלוחית המיקרו-פלואידיג והחליפו אותו במדיום טרי שחומם מראש ל-37 ° c, כפי שמתואר במדריך למשתמש של תוכנת microfluidic. אטום את הצלחת המיקרופלואידיג למערכת הסעפת ולחץ על כפתור הקרקע . מניחים את הצלחת microflu, עם מערכת סעפת על הבמה במיקרוסקופ ומחממים ב 37 ° c עבור ~ 2 h לפני תחילת רכישת המיקרוסקופיה.הערה: שלב זה לחימום מראש הוא קריטי כדי למנוע את התרחבות של התא microflu, אשר היה לשנות את המיקוד של המיקרוסקופ במהלך ניסוי זמן הקפיצה ולהתפשר על רכישת תמונה. . אטום את צלחת המיקרופלואידיג החלף את המדיום מ 8 עם 150 μL של מדגם התרבות ולהחליף את המדיום מ-1 עד 5 על ידי המדיום הרצוי עם או בלי מגיב ממריץ את המתח. הציבו את הצלחת המיקרופלואידים. והניחו אותו על הבמה על התוכנה microfluidic (ראה טבלת חומרים) להפעיל את הליך טעינת התא. בדוק כי הטעינה של התאים הוא משביע רצון על ידי התבוננות מתחת למיקרוסקופ באור משודר. הפעל את הליך טעינת התא פעם שנייה אם צפיפות התא בחדר אינה מספיקה. בצע מיקוד קפדני במצב אור משודר ובחר מספר שדות תצוגה המראה חיידקים מבודדים. חשוב לבחור שדות שאינם צפופים מדי כדי להיות מסוגל לפקח על התפתחותם של תאים מבודדים לאורך זמן (~ 10 לל20 תאים לכל 100 יקרומטר2 מומלץ). פעולה זו תסייע גם לזיהוי תאים במהלך ניתוח תמונה. בתוכנה microflu, לחץ על לחצן צור פרוטוקול. לתכנת את ההזרקה של מדיום הצמיחה עבור 1-2 שווי זמן דור כדי לאפשר לתאים להסתגל (אופציונלי). ואז לתכנת את ההזרקה של המדיום לגרימת מתח במהלך 10 דקות ב 2 psi, ואחריו הזרקה ב 1 psi למשך המבוקש של טיפול הלחץ. אם אתה מתכוון לנתח את ההתאוששות של התאים לאחר הלחץ, לתכנת את ההזרקה של מדיום גידול טרי למשך המבוקש.הערה: בניסוי המוצג כאן, cephalexin הוזרק עבור 10 דקות ב 2 psi, ואחריו 50 דקות ב 1 psi. אז, בינוני גדילה טרי הוזרק ב 2 psi עבור 10 דקות, ואחריו 3 h ב 1 psi. לבצע הדמיה מיקרוסקופית במצב פקיעה זמן עם מסגרת אחת כל 10 דקות באמצעות ניגודיות הפאזה באור משודר ו-560 ננומטר מקור אור לאות מטעם mCherry אם נדרש.הערה: חשוב להתחיל רכישת תמונה מיקרוסקופית באותו זמן כמו התחלת הפרוטוקול הזרקת microfluidic. 6. ניתוח תמונה הערה: סעיף זה מתאר בקצרה את שלבי המפתח של עיבוד וניתוח של תמונות מיקרוסקופית והערות זמן. פתיחה והדמיה של תמונות מיקרוסקופית מתבצעת עם ImageJ/פיג ‘ י הקוד הפתוח (https://fiji.sc/)11. ניתוח תמונה כמותי מבוצע באמצעות ImageJ/התוכנה קוד פתוח ביחד עם תוסף MicrobeJ חינם12 (https://microbej.com). פרוטוקול זה משתמש בגירסה MicrobeJ 5.13 I. פתח את תוכנת פיג’י ואת תוסף MicrobeJ. לניתוח תצלומי בזק, שחרר את כל התמונות המתאימות לשקופית מיקרוסקופ אחת (מדגם אחד) לתוך סרגל הטעינה MicrobeJ כדי לשרשר תמונות ולשמור את הקובץ ערימות תמונה שהתקבלו. עבור נתונים בזמן פקיעה, פשוט לשחרר את ערימת התמונה לתוך פס הטעינה של MicrobeJ. הפעל את הזיהוי האוטומטי של קווי המתאר של התאים בהתבסס על פילוח של תמונת חדות הפאזה, ואם רלוונטי, של הנוקלאונואידים המבוססים על פילוח של אות הקרינה הפלואורסצנטית ה-DNA המוכתם. בדוק את הדיוק של זיהוי התא באופן חזותי והשתמש בכלי העריכה MicrobeJ לתיקון במידת הצורך. שמור את קובץ התוצאות שהתקבל.הערה: ההגדרות המשמשות לזיהוי תאים של E. coli מסומנות בטבלת החומרים (ראה הערות/תיאור עמודה של microbej). למינים בקטריאליים אחרים (במיוחד עבור חיידקים שאינם בצורת מוט), המשתמש חייב למקד את ההגדרות לפני האיתור (ראה MicrobeJ הדרכה). עבור תמונות מעידה בזמן, הפעלת זיהוי אוטומטי למחצה של התאים באמצעות כלי העריכה MicrobeJ עשוי להיות מועדף כדי לאפשר התמקדות בגורלם של תאים בודדים (ראה MicrobeJ הדרכה). לחץ על resultj סמל כדי להשלים את הניתוח ולקבל את חלון resultj . ניתן להפיק סוגים שונים רבים של תרשימי פלט מנקודה זו. התוויית היסטגרמות מנורמלות של צורת התאים/אורך ומספר נוקלאואיד ממוצע לכל תא.