Denne protokol tillader en tidsløst beskrivelse af bakterievækst under stressforhold på enkelt cellen og cellernes populations niveauer.
Analyse af bakterie evne til at vokse og overleve under stress betingelser er afgørende for en bred vifte af mikrobiologiske undersøgelser. Det er relevant at karakterisere reaktionen af bakterieceller til stress-inducerende behandlinger såsom udsættelse for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, bestråling, ikke-fysiologisk pH, temperatur, eller saltkoncentration. Forskellige stress behandlinger kan forstyrre forskellige cellulære processer, herunder celledeling, DNA-replikation, proteinsyntese, membran integritet eller celle cyklus regulering. Disse virkninger er normalt forbundet med specifikke fænotyper på cellulær skala. Derfor kræver forståelse af omfanget og årsagssammenhæng af stress-induceret vækst eller levedygtighed mangler en omhyggelig analyse af flere parametre, både på enkelt cellen og på befolkningsniveau. Den eksperimentelle strategi præsenteres her kombinerer traditionel optisk tæthed overvågning og plating assays med enkelt-celle analyseteknikker såsom flow flowcytometri og realtid mikroskopi Imaging i levende celler. Denne multi Scale-ramme giver en tidsløst beskrivelse af stress betingenes indvirkning på en bakterie populations skæbne.
Det overordnede formål med denne protokol er at analysere adfærden af bakterieceller udsat for stress behandlinger på befolkningen og på enkelt celle niveauer. Bakteriel vækst og levedygtighed er traditionelt behandles på befolkningsniveau ved hjælp af optisk tæthed overvågning (OD600Nm), som er en proxy af bakteriecelle masse syntese, eller ved plating assays at bestemme koncentrationen af levedygtige celler i kulturen (koloni danner enhed per milliliter, CFU/ml). Under normale (ustressede) vækstbetingelser, er OD600Nm og CFU/ml målinger strengt korrelerede, fordi bakteriel fordobling tid afhænger direkte af cellemasse stigning1,2. Men, denne sammenhæng er ofte forstyrret under forhold, der påvirker cellemasse syntese3, celle division4, eller at udløse celle lysis. Et simpelt eksempel er tilvejebragt af stress behandlinger, der hæmmer celledeling, hvilket resulterer i dannelsen af filamentøse bakterieceller5,6. Filamentøse celler forlænges normalt, fordi cellemasse syntesen er upåvirket, men de er ude af stand til at opdele i levedygtige celler. Den optiske kultur tæthed vil derfor stige med tiden med en normal hastighed, men ikke koncentrationen af levedygtige celler bestemt ved plating assays (CFU/mL). I dette tilfælde, som i mange andre, optisk tæthed og plating målinger er informative, men undlader at give en omfattende forståelse af den observerede stress-induceret effekt. Disse ensemble assays skal kombineres med enkelt celle analyseteknikker for at muliggøre en dybtgående karakterisering af stress-induceret vækst mangler.
Her beskrives en procedure, der kombinerer fire komplementære eksperimentelle tilgange: (1) traditionelle plating assays og grundlæggende optisk tæthed overvågning til at overvåge cellelevedygtighed og cellemasse syntese, henholdsvis; (2) flow cytometri til at evaluere Cellestørrelse og DNA-indholds parametre på et stort antal celler; (3) mikroskopi snapshot Imaging til at analysere celle morfologi; og (4) time-lapse enkelt celle-billeddannelse i mikrofluidisk kamre til undersøgelse af den tidsmæssige dynamik celle skæbne. Denne multi-skala ramme gør det muligt at fortolke de globale virkninger på cellevækst og levedygtighed i lyset af de enkelte cellernes opførsel. Denne procedure kan anvendes til at dechifrere reaktionen fra forskellige bakteriearter til stort set enhver stress af interesse, herunder vækst under særlige forhold (dvs. vækstmedium, pH, temperatur, saltkoncentration), eller udsættelse for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser.
Det er vigtigt at være opmærksom på vækst tilstand af cellerne under proceduren. Udvid cellerne over flere generationer, før du når en fuld eksponentiel fase. For succesen med denne metode, er det vigtigt, at alle celler prøver indsamles samtidigt, og det er bedst at analysere kun én behandlet og en ubehandlet kultur på samme tid. Celleprøver til mikroskopi-billeddannelse skal opretholdes ved forsøgstemperaturen under hele proceduren. Det er så vigtigt at forvarme mikroskop kammeret og mikrofluidisk kammer før begyndelsen af forsøget. Hvis celleprøver til strømnings cytometri ikke kan analyseres let, kan de holdes på is i op til 6 timer. inkubation på is vil begrænse væksten og morfologiske modifikation af cellerne. Alternativt kan brugeren overveje at bruge fiksering af cellerne i ethanol 75%, hvilket normalt anbefales til strømnings cytometri10. Hvis protokollen kræver at vaske stress indutoren fra mediet, centrifugeres og pipetter celler meget omhyggeligt for at undgå at beskadige de potentielle afvigende celler.
Både flow flowcytometri og snapshot analyse giver adgang til Cellestørrelse og DNA-indholds parametre, med Snapshots, der giver yderligere observation af cellens morfologi. DNA-farvning med DAPI10 (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol) eller andre stabile DNA-farvestoffer kan udføres, hvis der ikke er nogen fluorescerende fusion til rådighed til at observere nucleoider i organismen af interesse. Hvis flowcytometry analyse ikke kan udføres, er det vigtigt at billede og analysere et stort antal celler ved mikroskopi.
Mikroskopi Imaging kan også udføres ved hjælp af stammer, der transporterer fluorescerende fusioner til proteiner, der er involveret i specifikke veje af interesse. Dette ville bidrage til at afsløre effekten af stress på en række cellulære processer såsom replikation, transskription, cellevæg syntese, eller celle division. Metoden kan anvendes på en række bakteriearter, idet det eneste krav er, at det mikrofluidiske apparat skal være kompatibelt med cellernes morfologi. Standard mikrofluidisk plader er bekvemme for stang-form bakterier med en cellebredde mellem 0,7 μm og 4,5 μm. Dog skal cocci, ovococci eller andre bakteriestammer med ejendommelige former testes. Alternativt, hvis der ikke kan udføres mikrofluidiske eksperimenter på grund af manglende tilgængelighed af udstyret eller uforenelige bakteriestammer, kan tidsforskudt billeddannelse udføres på agopstået-monterede slides i en maksimal varighed på 2 timer.
Den samlede fordel ved denne multi-skala analyse er at give en global vision af effekten af stress induktion på flere aspekter af bakterievækst evne (dvs. masse syntese, cellelevedygtighed, celle morfologi, membran integritet, DNA-indhold) og den måde disse udvikler sig med tiden i en bakteriepopulation vokser under stress betingelser. Det giver også mulighed for at analysere genoprettelsen af normal vækst på enkelt celleniveau og befolkningsniveau. Tilgangen gælder for en lang række bakteriearter og for praktisk talt enhver form for STRESSBEHANDLING, såsom udsættelse for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, analyse af indflydelsen af interaktion med andre organismer i flere arter populationer eller virkningen af genetisk mutation.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker F. Cornet for at give Hupa-mCherry Strain, a. Dedieu for teknisk assistance med cytometry, og a. ducret for at få hjælp til MicrobeJ. Finansiering: C. Lesterlin anerkender INSERM-og CNRS-institutioner samt ATIP-Avenir-programmet, Schlumberger Foundation for Education and Research (FSER 2019), ANR-finansieringen for PlasMed-forskningsprogram (ANR-18-CE35-0008) samt FINOVI til finansiering af J. Cayron; La Ligue contre Le Cancer til finansiering af flow flowcytometer udstyr. Forfatter bidrag: C.L. og J.C. designet proceduren og skrev papiret; J.C. udførte eksperimenterne og analyserede dataene.
Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |