Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.
Abstract
La diferenciación in vitro de células madre embrionarias humanas (HESC) ha transformado la capacidad de estudiar el desarrollo humano a nivel biológico y molecular y ha proporcionado células para su uso en aplicaciones regenerativas. Los enfoques estándar para el cultivo de hESC utilizando el cultivo de tipo colonia para mantener los hESC indiferenciados y la formación de rosetas y cuerpo embrionario (EB) para la diferenciación en diferentes capas germinales son ineficientes y consumen mucho tiempo. Aquí se presenta un método de cultivo de una sola célula que utiliza hESC en lugar de una referencia cultural de tipo colonia. Este método permite el mantenimiento de las características características de los hESC indiferenciados, incluida la expresión de marcadores hESC a niveles comparables a los hESC de tipo colonia. Además, el protocolo presenta un método eficaz para la generación de células progenitoras neuronales (NPC) a partir de hESC de tipo de una sola célula que produce NPC dentro de 1 semana. Estas células expresan altamente varios genes marcadores NPC y pueden diferenciarse en varios tipos de células neurales, incluyendo neuronas dopaminérgicas y astrocitos. Este sistema de cultivo de una sola célula para hESCs será útil para investigar los mecanismos moleculares de estos procesos, estudios de ciertas enfermedades y pantallas de descubrimiento de fármacos.
Introduction
Las células madre embrionarias humanas (HESC) tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas primarias de gérmenes, que luego se diferencian en varios linajes de células progenitoras multipotentes. Estos linajes posteriormente dan lugar a todos los tipos de células en el cuerpo humano. Los sistemas de cultivo hESC in vitro han transformado la capacidad de estudiar el desarrollo embrionario humano y han servido como una valiosa herramienta para obtener nuevos conocimientos sobre cómo estos procesos se regulan a nivel biológico y molecular. Del mismo modo, los estudios de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) generadas a partir de la reprogramación de células somáticas aisladas de pacientes humanos proporcionan nuevos conocimientos sobre diversas enfermedades. Además, el progenitor y las células diferenciadas derivadas de los HEC pueden ser útiles para la investigación que involucra terapia con células madre y detección de drogas1,2,3,4.
Los hESC se pueden inducir a diferenciarse en células progenitoras neuronales (NCC), que son células multipotenciales con una amplia capacidad de autorenovación. Posteriormente, estas células se pueden diferenciar en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos5,6. Los PNJ también ofrecen un sistema celular para estudios in vitro de biología del neurodesarrollo y diversas enfermedades neurológicas. Sin embargo, los métodos actuales de cultivo de tipo colonia que implican heSC y su diferenciación en NNP son ineficientes y a menudo implican cocultivo, así como formación de cuerpo embrionario (EB) y formación de rosetas5,7,8,9. Estos protocolos presentan tasas de supervivencia más bajas y diferenciación espontánea y consumen más tiempo.
Aquí se presenta un sistema de cultivo mejorado y robusto que es fácilmente escalable y utiliza el cultivo de tipo de una sola célula de alta densidad de hESCs10. La inclusión del inhibidor de la roh-quinasa (ROCK) contribuyó a mejorar significativamente la eficiencia de supervivencia durante el cultivo de tipo de célula única de hESC10,11,12,13,14. En este sistema de cultivo, los hESC se pueden mantener y ampliar fácilmente. Además, el protocolo presenta un método eficiente para generar PNJ a partir del cultivo de tipo de una sola célula de hESC, lo que permite la producción de PNJ altamente puros.
En resumen, el protocolo de cultivo de tipo de una sola célula que utiliza hESCs ofrece un modelo atractivo para estudiar la diferenciación de estas células en varios linajes, incluidos los PNJ. Este protocolo es fácilmente escalable y por lo tanto adecuado para generar células para la investigación que involucra terapia regenerativa y cribado de drogas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos escalables y eficientes para la diferenciación de los HEC en varios linajes y la generación de un número suficiente de células diferenciadas son criterios importantes para la detección de fármacos y la terapia con células madre. Se han publicado varios métodos de paso de una sola célula, en los que las células se cultivan en presencia de inhibidores de LA NAdo u otras moléculas pequeñas para mejorar la supervivencia, pero los productos finales de estos métodos de cultivo son los hESC de tipo col…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) por su asistencia con el análisis FACS. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, los Institutos Nacionales de Salud, Z01-ES-101585 a AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
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