아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리

그람 음성 박테리아는 주변 공간과 펩티도글리칸 세포벽^1에의해 분리되는 2개의 막을 일으킵니다. 내부 막 (IM) 사이토솔을 감싸고 인지질의 대칭 이중층이다. 펩티도글리칸은 터고 압력으로부터 보호하고 세포 형상을 가진 박테리아를 제공하며, 지단백질^2,,3에의해 외부 막(OM)에 부착된다. OM은 주변을 둘러싸고 있으며 주로 비대칭입니다. 내부 리플렛은 인지질로 구성되며 외부 리플리피드(LOS) 또는 리포폴리당당(LPS)^4,,5로구성된다. 외부 리플렛에서 LOS/LPS 분자의 지질 비대칭 및 생화학은 그 환경의 위험으로부터 박테리아를 보호하는 세포 표면에 장벽^특성을부여한다^6,7.

LPS 분자는 3개의 성분으로 구성됩니다: 지질 A 이시카롤리피드, 코어 올리고당, 및 O-다당류 또는 O 항원. 지질 A는 곱한 비실화 된 디실로리피드입니다. 코어 올리고당은 거친 LPS 또는 R-LPS로 알려진 10-15 개의 설탕으로 구성됩니다. 코어는 2-케토-3-데옥시-D-만노 옥투로소닉산(kdo) 및 하나 이상의 헵토스 잔류물, 그리고 일반적으로 육각(포도당 또는 갈락토제) 및 헥토스, 또는 아세타미도 당분^5로구성된 외부 영역으로 구성된 내부 영역으로 세분화된다. 외부 코어 영역은 내부 코어보다 구성 요소 및 구조에서 더 가변적입니다. 살모넬라 spp.,오직 하나의 코어 구조만 기술되었다; 그러나, 대장균에는 다섯 가지 핵심 구조 (K-12, R1, R2, R3 및 R4)가^{8있습니다.} 이 절차에서 사용하는 대장균 K-12 DH5α는 생산 R-LPS^9의결과를 초래하는 돌연변이를 전달합니다. R-LPS 분자는 O 항원 moiety 부족 하 고 LOS 분자와 비슷한 분자량을 가지고.

R-LPS에 O 항원추가는 이 분자를 매끄러운 LPS, 또는 S-LPS로 바꿉니다. O 항원 짧은 3-4 탄수화물 하위 단위에서 구축 하 고 다양 한 체인 길이 여러 양식으로 구성^10. 살모넬라 테네리카 혈로바르 티피무리움(S.S 티피무리움) 표면^10,,11에LPS 분자의 트리모달 분포를 표시한다. 매우 긴 사슬 O 항원은 100개 이상의 하위 유닛을 포함하고 100킬로달톤 이상의 무게를 견딜 수 있습니다. O 항원 항생제저항, 박테리오파지에 의한 포식 회피, 질병 유발에 필요한 박테리아에 표면 특성을 제공합니다.

캄필로박터, 보르데텔라, 아시네토박터, 헤모필루스, 네이세리아 등의 종은 표면에서 LPS 분자 대신 LOS 분자를 생성한다^12. LOS 분자는 지질 A및 코어 올리고당으로 이루어져 있지만 O 항원이 부족하다. 이러한 유형의 그람 음성 박테리아는 표면 특성을 변경하기 위해 추가의 설탕 및 당조합으로 그들의 핵심 올리고당을^{수정한다 12.} LOS 및 LPS 생산 미생물 모두 지질 A에 인산염을 생성하고 양이온성 모아티^7을가진 코어 분자. 이러한 추가는 항이온성 표면 전하를 중화하고 양이온 항균 펩티드로부터 보호함으로써 기능하는 인산화탄올아민, 갈락토사민 및 아미노아라비노스 치환을 포함한다. 그람 음성 박테리아는 또한 당분, 또는 여분의 kdo 분자의 가변 비-stoichiometric 치환으로 코어 올리고당 구조를 수정하고, 지질-A 디사카롤리피드에 아실 사슬의 수를^변경7.

그람 음성 박테리아의 OM으로부터 IM을 분리하는 능력은 항균성 내성 및 질병 병인에서 세포 봉투의 역할을 이해하는 데 중요한 역할을 하고있다^11,,12. 이 접근법의 유도체는 OM에 대한 단백질, 인지질 및 글리콜리파이드 성분의 조립, 유지 보수 및 리모델링의 메커니즘을 추론하는 데 사용되어 왔다.

저희 실험실은 정기적으로 세균성 지질 분석을 수행하여 다양한 그람 음성 종에서 단백질 매개 지질 조절 및 지질 기능을 연구합니다. 프로토콜에 사용되는 부피는 얇은 층 크로마토그래피 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법에 의해 비 방사성 표지 된 인지질을 분석하기 위해이 절차의 일상적인 사용을^{반영13,,14.}

프로토콜은 그람 음성 박테리아의 차가운 현탁액을 자당의 높은 삼투압 용액에 노출시키고 기본 펩티도글리칸 층으로부터 OM을 해리시키기 위해 리소자임(lysozyme)을 첨가함으로써 시작된다(도1)^12. EDTA는 리소자이메의 침투를 용이하게 하기 위해 첨가되는데, 이는 인접한 LOS/LPS^분자(15)사이의 측면 정전기 브리징 상호작용을 방해하기 때문에 양이온 격리가 중단되기 때문에. 우리의 적응 된 원래 프로토콜은 구형의 형성을 필요로, 플라즈마 막과 시토솔로 구성된 그람 음성 세균 세포 형태, 하지만 펩티도글리칸 층과 OM부족. 구형 세포가 적응 된 방법에 의해 생성 될 수 있습니다. 그러나, 기술은 성공을 위해 그들의 형성에 의존하거나 의도하지 않습니다. 대신, 리소자임-EDTA 처리 된 박테리아는 원심 분리에 의해 빠르게 수확되고 가압 용해 전에 낮은 농도의 자당 용액에서 다시 중단됩니다. 구형 세포를 형성하여 방출되었을 수 있는 OM은 이론적으로 처리된 세포의 상황체로부터 수확할 수 있어야 하지만, 이 접근법은 여기에 상세히 설명되어 있지 않다. 궁극적으로, 처리된 세포는 종래의 균질화 및 용해를 행하며, 이는 막 분리^{절차(16)의}효율 및 재현성을 향상시킨다.

용해 후, 총 멤브레인은 초원심분리에 의해 수집되고 EM 및 OM을 분별하기 위해 불연속 자당 밀도 구배를 적용합니다. 고전적인 접근법은 적어도 5개의 상이한 자당 용액^11,,12로구성된 보다 연속적인 그라데이션을 사용한다. 우리의 프로토콜의 불연속 그라데이션은 세 가지 자당 솔루션으로 구성되며 이중 층을 두 개의 별개의 분획^17로분할합니다. 그람 음성 박테리아의 OM 내의 LOS 및 LPS 분자는 봉투를 상부 갈색 저밀도 IM 분획 및 하부 백색 고밀도 OM 분획으로 분할하도록 유도한다(도1 및 도 2).

아신토박터 바우만니는 그들의 OM에서 LOS 분자를 생성하고^,18,19를분리하기 어려운 세포 봉투를 세우는 중요한 다제 내성 인간 병원체이다. 최근 연구는 우리가 여기에 존재하는 프로토콜의 유도가 이러한 유기체^(20)의이중 층을 분할하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 따라서 A. baumannii 17978에서 프로토콜을 테스트했습니다. 처음에는 절차가 부적절했습니다. 그러나, 중간 밀도 용액의 자당 농도를 수정하고 분리를 크게 개선하였다(도2). NADH 탈수소 효소 분석 및 LOS/LPS 추출 및 검출 절차는 A. baumannii,야생형 S에 대한 분리를 확인하기 위해 사용되었다. 티피무륨 및 2개의 O-항원 결핍 장균 유전자형; 즉, galE-돌연변이 S. 티피무륨 및 실험실 균주, 대장균 DH5α(도3 및 도 4).

이 작업의 의도는 그람 음성 박테리아의 막을 재현 하 게 격리에 대 한 간소화 된 접근 방식을 제공 하는. 프로토콜은 이 세균을 위한 막 관련분자의 많은 모형을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.