자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

1. 분석에 필요한 예비 단계 참고(중요): 오염을 방지하기 위해 모든 예비 단계는 멸균 환경에서 수행되어야 합니다. 아지드 나트륨은 고추냉이 과산화효소(HRP) 효소의 활성을 저해할 수 있으므로 저장에 사용해서는 안 된다. 러닝 버퍼(100 mM HEPES, pH 7.5)를 준비하고, (4-(2-하이드록세틸) 피페라진-1-에탄설포닉산을 사용하고, 트웬 80을 0.01%(v/v)의 농도로 첨가한다. 공급 업체가 제공하는 프로토콜에 따라 NHS 활성화 자기 마이크로 비드의 표면에 1 차 항체 (포획 항체)를 고정시. 간단히, 자기 IP /공동 IP 키트(재료의 표)프로토콜은 다음 단계를 포함합니다. 비드 0.2 mL(2 mg)을 플라스틱 튜브에 넣고 상류를 제거한다. 얼음 차가운 1 mM HCl의 1 mL을 추가하여 구슬을 씻는다. 선택된 항체(항인간 혈청 알부민[15C7], Rb 항-BG 폴리클로날, Rb항-대장균 MRE 162 폴리클로날 또는 염소 항-MS2 폴리클로날), 40 μg/mL을 67 mM 의 보레이트 버퍼, 37°C에서 흔들림으로 1시간 동안 구슬에 공유한다. 표 1은 현재 프로토콜 및 항원 병원체와 함께 사용되는 모든 항체의 리스트를 포함한다6. 0.8 mL의 용출 완충제로 언바운드 항체를 두 번 세척합니다. 1 시간 동안 담금질 버퍼의 1 mL로 반응을 담금질하십시오. 수정된 붕산염 버퍼로 구슬을 한 번 씻고 IP Lysis/워시 버퍼로 한 번 세척합니다. IP 용해/세척 버퍼의 0.5 mL에 구슬을 다시 일시 중단하고 사용이 필요할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.참고: 최상의 결과를 위해, 새로운 마이크로비드 배치는 EWOD 격리 및 ELISA 온칩 전날 항체에 결합됩니다. 그러나, 1차 항체에 결합된 마이크로비드는 4°C에서 최대 1개월까지 저장할 수 있다. 응집이 발생하면 바이알을 탭하여 침전물을 부수고 용액의 구슬을 다시 일시 중단합니다. 100 mMM 인산 완충 식염수 (PBS)에서 차단카제인 (1 % w / v)에서 마이크로 비드에 대한 최종 농도 4 mg / mL을 사용하여 밤새 결합 된 항체로 마이크로 비드를 차단합니다.참고: 차단 단계는 항상 생체 검출 분석 실행 전날 실시됩니다. 자석을 사용하여 차단카제인에서 구슬을 분리하고 상류제를 제거합니다. 실행 버퍼의 1 mL에서 다시 일시 중단하고 1 분 동안 혼합합니다. 자석을 사용하여 구슬을 분리하고 상한을 제거합니다. 위의 세척 단계(1.2.10 및 1.2.11)를 두 번 반복합니다.참고 : 세 가지 세척 단계는 표면에 구슬의 접착을 줄이고 물방울의 자유로운 이동을 용이하게하기에 충분하다. 2.5 mg/mL의 농도로 실행 중인 버퍼의 비드를 다시 일시 중단합니다. 이 마이크로비드 솔루션은 EWOD 칩과 함께 사용할 준비가 되었습니다. 뉴트라비딘 컨쥬게이트 고추냉이 과산화증(HRP) 및 이차 생체화 항체의 용액을 러닝 버퍼에서 각각 1 μg/mL에 대한 최종 농도로 준비한다(BG검출6에사용).참고: 항원(표1)을표적으로 하기 위해 0.5~4.0 μg/mL에 이르는 이차 생체질화 항체의 다양한 농도를 성공적으로 시험하였다. 분석법을 실행하기 직전에 루미놀과 과산화수소 용액의 동일한 부피를 혼합하십시오.참고: 루미놀은 항원(예를 들어, 병원체)을 표적으로 하는 이차 항체에 공유적으로 결합되는 HRP 효소에 기초한 결합 이벤트의 수를 정량화하는 데 사용된다. 그러나, 상이한 보고 분자 및 전략은 화학발광 및 루미놀 대신에검출(17)을 위해 사용될 수 있다. 2. EWOD 칩 부품의 제조 및 표면 처리 참고: EWOD 칩은 액적의 뚜렷한 접촉 각을 번갈아 가며 액적의 높이를 정의하는 패턴 크롬 전극이 있는 작동 판으로 구성됩니다. 표준 CAD 소프트웨어를 사용하여 전극과 커넥터의 설계를 2D로 그립니다. 사용된 용매를 저장하기 위해 5 x 5 mm2의 치수를 가진 폐기물 수집 패드도포함한다(그림 1).참고 : 물방울을 조작하려면 각각 1.7 x 1.7 mm2의치수를 가진 47 개의 전극을 사용합니다. 이 전극 크기는 1.5 μL에서 3 μL에 이르는 액적 부피를 수용합니다(500 μm 간격의 경우). 경험에서 500 μm 간격으로 작업할 때 1.5 μL은 작동할 수 있는 최소 액적 크기입니다. 그것은 사각형 패드에 외사되는 물방울 (투영) 윤곽에 대략 해당합니다. 그러나, 유체의 신체의 저항(마찰)에 의해 야기되는 것 이외에 는 어떠한 이론적 제한도 없다. 그럼에도 불구하고 500 μm 간격을 사용하여 신뢰할 수 있는 작동을 위해 부피가 3 μL을 초과하지 않는 것이 좋습니다. 전극은 48채널 전자 장치로 처리됩니다.참고: 패드의 설계 치수와 크기는 프로토콜을 구성하는 의도된 부량 및 실험실 단위 운영(Luos)에 따라 달라질 수 있습니다. 크롬 마스크를 유리 기판에 인쇄하기 위한 마스크 제조 서비스로 설계 도면을 보냅니다. 크롬 층의 두께는 100 nm입니다.참고: EWOD 칩의 기판으로 사용되는 포토마스크의 크롬 층은 정의상 불투명합니다. 각 전극의 설계에는 반투명도를 보장하기 위한 그리드 레이아웃이 포함되어 있습니다. 정밀 CNC 다이싱 / 절단 톱으로 56 x 56mm2의 크기로 플레이트를 잘라냅니다. 두 코팅 단계에서 분리하기 위해 전기 접점 위에 마스킹 테이프를 붙입니다. 6 μm Parylene-C를 표면에 증착하여 판 크롬 유리 판을 유전체 층으로 코팅합니다. 고함 공정18은 파릴렌 증착시스템(재료 표)에서7.4 g의 DPX-C와 함께 사용된다. 스핀코트 비정질 불소중합체(재료표)를플레이트 위에 30s에 대해 1500 rpm에서 스핀 코터를 사용하여 30분 동안 140°C에서 구워줍니다.주: 이렇게 하면 표면 소수성 렌더링됩니다. 하나는 표면에 물 방울을 배치하여 코팅이 성공적으로 증착되었는지 여부를 확인할 수 있습니다. 액적과 플레이트 사이의 접촉 각은 110º 의 영역에 있어야 합니다. 전기 접점에서 마스킹 테이프를 제거합니다. 스핀코트 비정질 불소 중합체(표)를 사용하여 1500 rpm에서 30s의 4인치 실리콘 웨이퍼 위에 30s의 스핀 코터를 사용하여 140°C에서 30분 동안 구워줍니다.참고 : 분석 기간 동안 이산 방울의 원활한 이동을 용이하게하기 위해 작동 및 커버 플레이트의 표면이 모두 소수성인 것이 중요합니다. 3. DMF 플랫폼에서 EWOD 칩의 로딩, 조립 및 작동 참고: EWOD 칩은 작동 플레이트와 전도성 접지 커버 플레이트 사이에 0.5mm의 간격을 정확하게 정의한 병렬 플레이트 구성을 사용하여 작동합니다. 이 샌드위치 어셈블리는 현재 섹션에 설명되어 있습니다. DMF 플랫폼6에서 뚜껑을 제거하고 벤치에 놓습니다.참고 : 어두운 패서데이 케이지 챔버는 검출 중에 미광 및 전자기 간섭을 방지하기 위해 필요합니다. 뚜껑에는 인터록이 없으므로 플랫폼을 통해 물방울의 움직임을 관찰 할 수 있습니다. 깨끗한 작동 판을 회전 단계에 놓고 크롬을 위쪽을 향하게 합니다. 플레이트는 오목한 스테이지의 왼쪽 위 모서리와 정렬되어야합니다(그림 2A). 47개의 접지 핀이 있는 패널을 사용하여 상단에서 작동 플레이트를 고정합니다. 이렇게 하면 플레이트가 제자리에 고정되고 접촉 핀과의 정렬이 용이합니다. 0.5 mm 심과 2 mm 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 분리기를 회전 스테이지상에 놓고, 작동과 커버 플레이트 사이의 제어된 간격을 제공한다.참고: 선택적으로, 위킹 페이퍼는 다음 단계 전에 물방울을 알리인용하기 전에 폐기물 처리 패드에 놓을 수 있습니다. 분석이 진행됨에 따라 폐기물은 분석의 끝에서 제거 될 수있는 종이에 직접 흡수됩니다. 액적을 제안된 로딩 패드에 로드합니다(그림1). Aliquot 4 개의 2.5-μL 방울을 실행 버퍼에서 B-, A-, R-, E-표시 패드, 각 패드에 1 방울. Aliquot 2.5 μL 의 루미놀:H2O2 (1:1, v/v) 용액을 D-표시 패드에. Aliquot 2.5 μL의 노이트라비딘은 F-표시 패드 에 HRP (1 μg/mL)로 공액화하였다. Aliquot 2.5 μL의 바이오티니티질이차전항체(1 μg/mL)를 G-표시 패드상에. 공액 1 차 항체 (2.5 mg / mL)를 가진 마이크로 비드의 Aliquot 2.5 μL은 I-표시 패드에 이동합니다. 알 수 없는 샘플의 2.5 μL을 C-표시 패드 에 Aliquot.참고: 제안된 로딩 패턴은 실험 레이아웃의 한 예에 불과하지만, 이러한 변경 사항이 소프트웨어에 정의된 순서와 일치하는 한 로딩 패턴을 사용자의 요구에 맞게 변경할 수있습니다(보충 파일 1). 커버 플레이트를 둥근 오목 영역 외에 리그 표면에 놓고 오목한 부분과 작동 판 의 상단에 측면으로 밀어 넣습니다(그림2B). 영구 자석을 커버 플레이트 위에 놓고 두 개의 래치를 슬라이딩하여 고정합니다(그림2C). 스테이지를 180° 회전하고 로드된 물방울이 여전히 제자리에 있는지 시각적으로 검사합니다(그림1C).참고 : 하나는 투명 한 단계와 액추에이션 플레이트의 뒷면을 통해 액적의 위치와 모양을 볼 수 있어야합니다(그림 2D). 로딩 전극 패드 위에 둥근 물방울이 보일 수 있다면 분석이 실행될 준비가 되었습니다. 경우, 물방울이 변위되면 자석과 커버 플레이트를 제거 한 다음 깨끗한 파이펫으로 변위 된 물방울을 회수하고 로딩 패드에 다시 놓습니다. 각 액적의 로딩 위치가 소프트웨어의 프로그래밍된 작동 순서와 일치하는지 확인합니다(소프트웨어에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1 참조).참고: 물방울의 위치를 육안으로 확인할 수 있도록 광검출기를 분리해야합니다(그림 2D). 스크리닝된 광검출기를 회전 단계의 슬롯에 “캔”으로 배치합니다.참고: 광검출 시스템은 광다이오드 주위를 회전하며, 넓은 수집 영역(10 x 10mm2)을통해 추가 광학 없이 광 수집을 최대화하고 노이즈6을최소화하기 위한 트랜스 임피던스 증폭기를 사용합니다. 그러나 시스템은 매우 민감하며 미세 신호를 수집할 수 있습니다. 소음 수준을 줄이기 위해 여러 가지 전자 기반 전략이 구현되었습니다(예: 광검출 시스템은 스크리닝된 “can”으로 알려진 금속 케이싱인 패데이 케이지에 배치하여 보호되었습니다). 케이블을 “캔”으로 선별된 광검출기에 연결합니다.참고: EWOD 칩이 광검출기에 정렬되면 DMF 플랫폼이 완전히 조립되어 작동할 준비가 되었습니다. DMF 플랫폼 위에 뚜껑을 놓고 허트포드셔 대학교에서 개발한 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 프로그램 순서를 시작합니다.참고: 추가 소프트웨어는 CSV 파일에서 시간 함수로 액적의 발광을 읽고 기록하는 데 사용됩니다(보조 파일 2참조). 프로그래밍된 시퀀스(보충 파일 1참조) 프롬프트 메시지가 인터페이스에 표시되어 운영자에게 “루미놀 방울이 추출된 자기 비드를 수집할 준비가 되었습니다” 또는 “검출 액적을 감지 사이트로 이동할 준비가 되었는지 확인합니다.” 두 경우 모두 시퀀스를 진행하려면 연산자의 확인이 필요합니다. 4. 시각적 모드에서 작동 (프로토콜 최적화를위한 선택 사항) 참고: 원하는 경우 모든 액적 기반 작업을 시각화하기 위해 3.10-3.12 단계를 건너뛰고 다음 작업으로 대체하여 분석기를 조작할 수 있습니다. 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 프로그램 순서를 시작합니다.참고: 시각적 모드에서 작동하는 동안 액적 이동을 관찰할 수 있으며, 이는 프로토콜 최적화 중에 유용합니다. 첫째, 자기 분리 작업의 재현성을 점검한다. 예를 들어, 사용되는 비드의 양이 너무 낮으면 자기 분리가 발생하지 않으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이며, 구슬의 양이 너무 높으면, 액적은 비드 펠릿에 의해 고정될 수 있다. 둘째, 일부 액적 제형으로서 새로운 분석법의 신뢰성을 확인하기 위해 관찰에 의해 검출될 수 있는 작동 장애를 야기할 수 있다. 메시지가 표시되면 회전 단계의 슬릿에 “캔”으로 선별된 광검출기를 장착합니다. 소켓에 핀을 삽입하여 케이블을 “캔”으로 선별된 광검출기에 연결합니다. DMF 플랫폼 위에 뚜껑을 놓고 분석작업을 다시 시작합니다.참고: CSV 파일에서 시간 함수로 물방울의 발광을 읽고 기록하기 위한 추가 소프트웨어를 사용하십시오(보조 파일 2참조). 5. 액체 폐기물을 제거하고 칩을 청소하십시오. 주의: 청소 전에 장비가 꺼져 있고 전원(컴퓨터, 주)에서 분리되어 있는지 확인합니다. 칩에서 생물학적 샘플을 제거 할 때 장갑, 실험실 코트 및 고글 보호 유리 (PPE)를 착용하십시오! 작동 플레이트의 전극과 사용된 용매에 액세스하려면 DMF 플랫폼 뚜껑을 열고 스테이지를 180°로 회전시려면 자석 케이스를 힌지 해제하고 회전 단계에서 자석을 제거하고 벤치에 놓습니다. 핀셋 한 쌍으로 슬릿에서 커버 플레이트 실리콘 웨이퍼를 제거하고 DI 물로 헹구고 압축 공기로 건조시키고 웨이퍼를 저장하고 재사용할 수있는 페트리 접시에 놓습니다. 마이크로파이펫을 사용하여 표면을 건드리지 않고 패드에서 액체 폐기물을 이동시면 됩니다. 흡수성 종이(필터 재료)를 사용하여 액추에이션 플레이트에서 액체를 배출하여 표면을 청소합니다.참고 : 표면을 그대로 유지하면 여러 용도로 사용할 수있는 작동 판의 수명이 증가합니다. 깨끗한 파이펫을 사용하여 깨끗한 DI 물방울로 전극 표면을 부드럽게 쓸어 서 작동 플레이트를 청소하십시오. 그런 다음 위킹 페이퍼 (필터 재료)로 물방울을 제거하십시오.주의: 생물학적 물질로 오염된 티슈, 종이, 파이펫 팁 및 장갑을 바이오 폐기물 쓰레기통에 폐기하십시오. 다른 분석법에 대해 작동 플레이트를 사용하거나 DMF 플랫폼에서 제거하여 보관 또는 재활용하십시오.