膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)を用いたヒト成熟性の単離と培養

スウェーデンのヨーテボリにあるサルグレンスカ大学病院で選択的手術を受けている女性患者の腹部から脂肪組織の匿名サンプルを採取した。すべての研究対象者は、組織の使用に関する書面によるインフォームド・コンセントを与える前に、書面および口頭情報を受け取った。研究は、ヨーテボリの地域倫理審査委員会によって承認されました, スウェーデン. 注 : この方法の概要を図 1に示します。 1. バッファー、組織培養培地、および培養プレートの調製 NaClの35.1 g、KClの1.75 g、KH2PO4の0.82 g、MgSO47H2Oの1.48 gを900 mLの水に溶解して、5xクレブスリンガー(KR)ストックを準備します。CaCl 2・2H2Oの1.84gを加え、水を加えて1Lに調整します。0.22 μm フィルターを通して滅菌フィルターを使用し、4 °C で保管します。 5x KRストックから、1X KR、25 mM HEPES、2 mMグルコース、および2%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む1Lのバッファーを準備する(後に洗浄緩衝液と称する)。pHを7.4に調整します。 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2、2% BSA、および450 mLの水(以下、消化緩衝液と称される)を含むコラゲターゼ緩衝液500mLを調製する。注:コラゲターゼは、脂肪組織がステップ2.2で計量されるまで消化緩衝液に添加すべきではありません。 ミディアム199のpHを7.4に調整します。 滅菌フィルターは、0.22 μm フィルターフラスコを介してバッファーおよび媒体 199 の両方をフィルターし、37 °C に暖めます。注:時間を節約するために、脂肪組織を処理する前に、組織培養培地を準備し、プレートに添加することができます。24ウェルプレートフォーマット(図1A)では、ダルベッコの改良イーグル培地/ハムの栄養混合物F12(DMEM/F12)、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)、20nMインスリンの0.5-1 mL/ウェルを使用します。低分子および他の安定な薬理学的薬剤もまた、所望のレイアウトで培地にこの時点で添加することができる。プレートを組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。 2. ヒト皮下脂肪組織の解剖 注:生物学的安全キャビネット内で作業し、隔離プロセス全体を通して滅菌技術を使用するだけでなく、オートクレーブおよび無菌装置の排他的な使用。 15cmのシャーレにヒト脂肪組織を入れ、解剖中に保湿状態に保つために少量の媒体199を加える。 ゴルフボールとほぼ同じ大きさの脂肪のピースを扱い、ピンセットで大きな線維性血管をつかみ、閉じたはさみで脂肪を掻き取って脂肪細胞をそっと放します。線維組織の大きな部分を捨てます。トリミングされた脂肪の重量を量る。 3. コラゲナーゼ治療 コラゲターゼを1mg/mLの濃度で消化バッファーに加えます(ステップ1.3を参照)。滅菌は0.22 μmの滅菌フィルターを使用して溶液をフィルターします。注:脂肪グラム当たり3mLの消化バッファーが推奨されます(すなわち、100gの脂肪の場合、300mgの2型コラゲナーゼを用いて300mLの消化バッファーを準備します)。注意:タイプ2コラゲナーゼは、目、皮膚に危険であり、呼吸器刺激を引き起こす可能性があります。手袋、目の保護を着用し、コラゲアーゼを扱う際に換気されたフードで作業してください。 約10gの脂肪組織を15cmのシャーレに移動させ、滑らかな均質な混合物になり、大きな脂肪が残らないまで、湾曲したはさみを使用して脂肪を慎重にミンチします。すべての脂肪が処理されるまで、このプロセスを繰り返します。注:各ラウンドは約2分を取る必要があり、脂肪片は、彼らが広いボアピペットチップを使用してピペットすることができるように十分に小さくする必要があります。このステップは、高品質のアディポサイトを生み出すために重要です。破片が大きすぎる場合は、消化時間を延長する必要があり、細胞の介振性を損なう。 スプーンを使用して50 mL円錐形のチューブにミンチ脂肪を転送します。各チューブに10mLの組織を10mL、消化緩衝液30mLを加えます。10 mL未満のミンチ脂肪が利用可能な場合は、適切な量にスケールダウンします。 30-45分間150rpmで一定の撹拌を用いて、37°Cで組織を消化します。30分後、過剰消化を避けるために5分ごとにプロセスをチェックしてください。注:脂肪溶液が大きな部分を持たずに均質で、アプリコット色を持っているとき、消化は完了します。 4. 細胞懸濁液の濾過と成熟性の薄膜細胞の精製 1L滅菌フラスコの上に漏斗を置き、漏斗の中に無菌250 μmのメッシュフィルターを置きます。消化されていない組織を除去するために、フィルターに消化脂肪溶液を注ぎます。 すべての透視細胞懸濁液がフィルターを通過したら、メッシュフィルターを静かに絞って、アディポサイトの収率を上げます。約50~100mLの洗浄バッファーをフィルターに注ぎ、洗浄し、フィルターを再度絞ります。 フラスコから分離したアジポサイト懸濁液を分離漏斗に注ぎ、漏斗がほぼ完全に満たされるまで洗浄バッファーを追加します。ファネルを数回軽く反転させ、アディポサイト懸濁液とバッファーを混ぜます。 2層の明確な分離(図1B)が存在するまで、2〜3分間の懸濁液を放置し、成熟脂肪細胞と遊離脂質を含むトップイエロー層と、緩衝液と脂肪質間質血管画分(SVF)を含む底層を有する。 分離漏斗のノズルを開き、下部溶液を滅菌フラスコにゆっくりと溶出させる(SVFの細胞は、200 x gで7分間ペレジレートして回収することができる)。分離漏斗の成熟した利細胞と最上層を保つ。 4.3~4.5の段階で洗浄プロセスを3回繰り返し、成熟した食状のアディポサイトを十分に洗浄し、コラゲターゼをすべて取り除きます。 5. 成熟した利状細胞のパッキング ノズルを開き、精製した成熟したアディポサイト懸濁液を50 mL円錐形のチューブに集め、 50 x gでチューブを3分間回転させることで、成熟したアディポサイトを軽く詰めます。 18G針と注射器を使用して、残りの洗浄バッファーをアディポサイト懸濁液の下に取り除きます。 ピペットを用いて成熟脂肪細胞の上に浮かぶ遊離脂質層(分離手順で壊れた脂肪細胞の小さな部分から油)を除去する。注:手順6.5で脂肪細胞が膜から滴り落ちるリスクを減らすために、成熟した脂肪細胞を膜に播種したときに脂質層とすべての洗浄バッファーが除去されたことが重要です。このため、3つのチューブでアディポサイトを収集します。最後に収集されたサンプルは、最も多くの持ち越し脂質を持ち、したがって、最も低品質になります。しかし、注意深くピペットでこれらのサンプルを使用することができます。 6. 成熟したアディポサイトの播種 透過性膜挿入物(材料表)を含むパッケージを開き、膜成分を取り出します。それを逆さまに反転し、膜が天井に面するように無菌表面に置きます。 各膜にパックされた成熟したアディポサイトのピペット30μL(図1C)。先端で膜に触れないようにしてください。広いボアピペットの先端を使用して細胞を播種するか、ハサミを使用してピペットチップの小片を切り取って広くします。 播種プロセス全体を通して、詰まったアディポサイトを含む50 mLチューブを数回静かに反転し、異なるサイズのアディポ細胞の均一な分布を確保します。 インキュベーターからメディアを含む準備されたマルチウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込み、蓋を取り外します。分化した膜を取り出し、下から掴んで、ステップ6.5で反転できるようにします。 ある滑らかな動きで、薄膜を上にして、種子化されたアディポサイトが下を向いてるようになりました(図1D)。画素を含むプレートを培地を含む井戸に下ろします(図1E)。 プレートの上に蓋を置き、慎重に組織培養インキュベーターにプレートを転送します。アディポサイトは最初に容易に外れる可能性があるため、プレートの急速な移動を避けてください。注:細胞が膜にしっかりと付着するまでに数日かかります。 7. 分析用の利逸細胞の維持と収穫 メディアを少なくとも 7 日ごとに変更します。各膜インサートの切り抜き穴を通してメディアを取り出し、追加します。培地を取り除くために、注射器と針、吸引杖、またはp200チップのピペットを使用します。培地を追加するには、ピペットを使用し、アディポサイトを乱さないように、壁の側面に沿って井戸にゆっくりと新しい媒体をピペットします。注:アディポサイトは、7日後に1つの培地変更で2週間培養されています。しかし、異なる脂肪源と実験的な質問は、増加したメディアの変化の恩恵を受ける可能性があります。 RNAを採取するには、ステップ7.1で説明した方法で培地を取り出し、500 μLのリシスバッファー(材料表)をウェルに直接加えて細胞を除去します。イメージングのために細胞を固定するには、1%の最終濃度でウェルに直接ホルムアルデヒドを加えます。注:細胞は4°Cで保存することができます。