Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi
Summary
Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.
Abstract
İnsan endometrium vücutta ki en hormonal duyarlı dokulardan biridir ve gebeliğin kurulması için gereklidir. Bu doku da hastalıklı olabilir ve morbidite ve hatta ölüme neden olabilir. İnsan endometrial biyolojisini inceleyen model sistemler, tek hücreli in vitro kültür sistemleri ile sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, endometriumun en önemli hücre tiplerinden biri olan epitel hücreleri, kültürdeki fizyolojik özelliklerini iyi yaymaz veya korumaz ve böylece endometriyal biyoloji anlayışımız sınırlı kalmaktadır. İlk defa insan endometriumunun hem epitel hem de stromal hücrelerinden oluşan endometrial organoidler oluşturduk. Bu organoidler herhangi bir ekzojen iskele malzemeleri gerektirmez ve özellikle epitel hücreleri küresel benzeri yapıyı kapsayacak şekilde düzenlemek ve üretmek ve kollajen salgılayan merkezinde stromal hücreleri ile polarize olur. Östrojen, progesteron ve androjen reseptörleri epitel ve stromal hücrelerde ifade edilir ve östrojen ve testosteron fizyolojik düzeyleri ile tedavi organoidlerin organizasyonu teşvik. Bu yeni model sistemi, normal endometriyal biyoloji ve hastalıkları daha önce mümkün olmayan şekillerde incelemek için kullanılabilir.
Introduction
İnsan endometrium hatları rahim boşluğu ve implantasyon sırasında embriyo için ilk temas olarak hizmet vermektedir. Endometrium luminal ve glandüler epitel hücreleri, destekleyici stromal fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Birlikte, Bu hücre tipleri seks steroid hormonları için en duyarlı dokulardan biri olan endometrial doku makyaj1. Her adet döngüsü sırasında meydana gelen değişiklikler çarpıcı. Embriyo implantasyonunun gerçekleşmesi için uygun büyüme ve endometriumun yeniden şekillendirilmesi gereklidir. Östrojen ve progesteron anormal yanıt gebeliğin başarılı kurulması için izin vermez ve hatta endometrial neoplazi de dahil olmak üzere hastalıklara neden olabilir refrakter bir endometrium neden olabilir.
Endometriumda oluşan hormon yanıtlarını ve temel değişiklikleri incelemek için ameliyat veya endometrial biyopsi sırasında hastalardan alınan endometrial dokulardan alınan hücreler hücre kültüründe yayılımkonusu olmuştur. Endometrial stromal hücreler tercihen çoğalır ve kolayca yayılır, ve progesteron tarafından indüklenen farklılaşma süreci in vitro recapitulated olabilir. Sonuç olarak, desidualizasyon2,3olarak adlandırdığı bu farklılaşma sürecinde çok şey öğrenilmiştir. Endometrium diğer önemli hücre tipi, luminal ve glandüler epitel hücreleri, ancak, polarite kaybetme, yaşlanma, yaşlanmak, ve sınırlı çoğaltıcı potansiyele sahip, geleneksel monolayers olarak iyi büyümek yok. Sonuç olarak, daha az biyoloji ve insan endometrium onların rolü bilinmektedir. Birçok neoplazi epitel hücrelerinden kaynaklandığı gibi, hiperplazi veya kanser hücrelerine dönüşüm ile ilişkili mekanizmalar tam olarak tanımlanmış olmaya devam etmektedir. Ayrıca, çalışmalar hormon yanıtı endometriumepitelve stromal hücreler arasında samimi parakrin eylemleri içerdiğini kurduk4 ,5.
Son zamanlarda, endometrial epitel hücrelerinin üç boyutlu (3D) organoid kültürü iki bağımsız grup tarafından kurulmuştur6,7, endometrial dokudan oluşan organoidlerin ilk raporları. Bu organoidler bir protein matrisi(Malzeme Tablosu)içine gömülü endometrial epitel hücrelerinden oluşuyordu ve endometrial endometriumun hormonal olarak duyarlı önemli bir bölmesi olan stromal fibroblastları içermiş. Matris proteinler çok dan çok değişebilir ve mutlaka dokuda meydana gelmez sinyal yolları tetikleyebilir gibi, endometrium bileşenleri ile matris proteinleri yerine ideal olacaktır. Mevcut çalışmada, insan endometriumunun epitel ve stromal hücrelerinin iskelesiz insan endometrial organoidlerinin oluşturulmasına bir protokol sunulmuştur. Stromal hücrelerin varlığı sadece epitel hücreleri için destek sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda endometriyal hormon yanıtı için önemli olduğu tespit edilen gerekli parakrin eylemleri de sağlar4,8,9 .
Yeni multisellüler endometriyal organoid oluşturmak için basit ve hem epitel hem de stromal hücreleri içeren endometrium bir model sistemi sunuyor. Bu organoidler hormonal dengesizlik veya eksojen hakaretler nedeniyle tümörigenez gibi hastalığın uzun süreli hormonal değişiklikleri ve erken olaylarını incelemek için kullanılabilir. Bu organoidlerin karmaşıklığı sonunda diğer hücre tipleri içerecek şekilde genişletilebilir, endotel ve bağışıklık hücreleri muhtemelen miyomsal hücreleri ile de dahil olmak üzere gerçekten insan doku fizyolojisi taklit etmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ekzojen iskele malzemeleri kullanılmadan endometriumun epitel ve stromal hücrelerinden oluşan insan endometriyal organoidleri ürettik. Birincil endometrial epitel hücrelerininorganoidler6,7oluşturabildiği gösterilmiş olsa da, bu hücreler fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan jelatinimsi bir protein matrisine gömülmüştür (bkz. Malzemeler Tablosu) spheroid benzeri yapılar oluşturur. Buna ek olarak, endometrial stromal hüc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIEHS/NIH/NCATS UG3 hibe (ES029073) ve Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge fund (JJK) tarafından finanse edilmiştir. Biz parafin katıştırma için sabit organoidler işleme için Northwestern Patoloji Çekirdek Tesisi kabul etmek istiyorum. Woodruff, Burdette ve Urbanek laboratuvarları da dahil olmak üzere tüm UG3 ekibini anlayışlı tartışmalar ve işbirlikleri için kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
- Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
- Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
- Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
- Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
