Summary

Generering av Multicellulära humana primära Endometrieorganoider

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Ett protokoll för att generera mänskliga primära endometrieorganoider som består av epitelial och stromaceller och behålla egenskaperna hos den infödda endometrievävnad presenteras. Detta protokoll beskriver metoder från livmoder vävnad förvärv till histologisk behandling av endometrieorganoider.

Abstract

Den mänskliga endometriet är en av de mest hormonellt lyhörd vävnader i kroppen och är avgörande för upprättandet av graviditeten. Denna vävnad kan också bli sjuka och orsaka sjuklighet och till och med döden. Modellsystem för att studera Human endometriebiologi har begränsats till in vitro-kultursystem av enstaka celltyper. Dessutom, de epitelceller, en av de stora celltyper av endometrium, inte propagera väl eller behålla sina fysiologiska egenskaper i kulturen, och därmed vår förståelse av endometriebiologi förblir begränsad. Vi har för första gången genererat endometrieorganoider som består av både epiteliala och stromaceller i det mänskliga endometrium. Dessa organoider inte kräver några exogena byggnadsmaterial och särskilt organisera så att epitelceller omfattar sfäroid-liknande struktur och bli polariserad med stromaceller i centrum som producerar och utsöndrar kollagen. Östrogen, progesteron och androgenreceptorer uttrycks i epitelial och stromacellstumörer celler och behandling med fysiologiska nivåer av östrogen och testosteron främja organisationen av organoider. Detta nya modellsystem kan användas för att studera normal endometriebiologi och sjukdom på ett sätt som inte var möjligt tidigare.

Introduction

Den mänskliga endometriet linjer livmoderhålan och fungerar som den första kontakten för embryot under implantation. Endometriet består av luminala och körtel epitelceller, stödjande stromacellstumörer fibroblaster, endotelceller och immunceller. Tillsammans, dessa celltyper utgör endometrievävnaden som är en av de mest responsiva vävnaderna till könshormonhormoner1. De förändringar som sker under varje menstruationscykeln är slående. Lämplig tillväxt och ombyggnad av endometriet krävs för att möjliggöra embryoimplantation förekomma. Aberrant svar på östrogen och progesteron kan resultera i en refraktär endometriet som inte tillåter för framgångsrik etablering av graviditet och kan även resultera i sjukdomar inklusive endometrieneoplasi.

För att studera hormon svaren och väsentliga förändringar som förekommer i endometrium, celler från endometrievävnader exciderade från patienter under kirurgi eller endometriebiopsi har propagerats i cellkulturen. Endometrial stromaceller celler företrädesvis föröka och propagera lätt, och processen för differentiering induceras av progesteron kan återfått in vitro-. Som ett resultat, mycket har lärt sig under denna differentiering process, kallas decidualization2,3. Den andra stora celltyp i endometrium, den luminala och körtel epitelceller, dock, inte växa bra som traditionella monolayers, förlora polaritet, blir senescent, och har begränsad proliferativ potential. Som ett resultat, mindre är känt av sin biologi och deras roll i det mänskliga endometrium. Så många neoplasi härstammar från epitelceller, mekanismer i samband med hyperplasi eller omvandling till cancerceller återstår att vara fullt definierade. Vidare, studier har fastställt att hormon svar innebär intima parakrin åtgärder mellan epitelial och stromaceller i endometriet4,5.

Nyligen, en tredimensionell (3D) Organoid kultur av endometrieepitelceller inrättades genom två oberoende grupper6,7, som är de första rapporterna av organoider bildas från endometrievävnad. Dessa organoider bestod av endometrieepitelceller inbäddade i en protein matris (tabell över material) och innehöll inte en viktig hormonellt lyhörd fack av endometrieendometriet, den stromacellstumörer fibroblaster. Eftersom Matrix-proteinerna kan variera från Lot till Lot och kan utlösa signalvägar som inte nödvändigtvis förekommer i vävnaden, skulle det vara idealiskt att ersätta Matrix-proteinerna med komponenter i endometrium. I den aktuella studien, ett protokoll för att generera scaffold-fria mänskliga endometrieorganoider av epiteliala och stromaceller i det mänskliga endometriet presenteras. Närvaron av stromaceller inte bara ger stöd för epitelceller utan också ger de nödvändiga parakrin åtgärder som har fastställts för att vara viktiga för endometriehormon svar4,8,9 .

Den nya multicellulära endometrieorganoid erbjuder ett modellsystem av endometriet som är enkel att generera och som innehåller både epitelial och stromaceller. Dessa organoider kan användas för att studera långsiktiga hormonella förändringar och tidiga händelser av sjukdom såsom tumorigenes på grund av hormonell obalans eller EXOGEN förolämpningar. Komplexiteten i dessa organoider kan så småningom utvidgas till att omfatta andra celltyper, inklusive endoteliala och immunceller med möjligen kan celler att verkligen efterlikna människans vävnadfysiologi.

Protocol

Endometrieprover samlades in från premenopausala kvinnor som genomgår rutinmässig hysterektomi för godartade livmoder förhållanden vid Northwestern University Prentice Women ‘ s Hospital, enligt en institutionell översyn styrelse-godkända protokoll. Skriftligt medgivande erhölls från alla kvinnor som ingick i studien. 1. beredning av Aguppstod formar Före början cell isolering, gjutna och jämvikt 1,5% aguppstod Micro formar (tabell över material) att hu…

Representative Results

En schematisk del av protokollet avbildas i figur 1. Livmoder vävnad erhölls från kirurgi efter det granskades av patologer. Endometriefodret separerades från myometrium genom skrapning och endometrievävnaden var enzymatiskt smälta till celler enligt beskrivningen i protokollet. Epitelial och stromacellstumörer celler sattes i mikrobrunnar i aguppstod formar. Efter 7 dagar i kulturen behandlades organoider med E och T i ytterligare 7 − 14 dagar. För hist…

Discussion

Vi har genererat mänskliga endometrieorganoider bestående av epiteliala och stromaceller i endometriet utan användning av exogena byggnadsmaterial. Även om det redan har visats att primära endometrieepitelceller kan bilda organoider6,7, var dessa celler inbäddade i en gelatinös matris av proteiner som utsöndras av mus sarkom celler (se tabell över material) för att hjälpa form sfäroid-liknande strukturer. Dessutom, endometriestromacel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie finansierades av NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) och Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Vi skulle vilja erkänna den nordvästra patologi Core facility för bearbetning av fasta organoider för paraffin inbäddning. Vi skulle vilja erkänna hela UG3 Team inklusive Woodruff, Burdette och Urbanek Labs för insiktsfulla diskussioner och samarbeten.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
check_url/kr/60384?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

View Video