En protokol til at generere humane primære endometriale organoider, der består af epiteliale og stromale celler og bevarer karakteristika af det indfødte endometrievæv præsenteres. Denne protokol beskriver metoder fra erhvervelse af uterin væv til histologisk behandling af endometriale organoider.
Den menneskelige endometriet er en af de mest hormonelt lydhør væv i kroppen og er afgørende for etablering af graviditet. Dette væv kan også blive syg og forårsage sygelighed og endda død. Model systemer til undersøgelse af menneskets endometriebiologi har været begrænset til in vitro-kultur systemer af enkelt celletyper. Hertil kommer, at epiteliale celler, en af de store celletyper af endometrium, ikke udbrede godt eller bevare deres fysiologiske træk i kulturen, og dermed vores forståelse af endometriecancer biologi fortsat begrænset. Vi har for første gang genereret endometriale organoider, der består af både epiteliale og stromale celler i den menneskelige endometrium. Disse organoider kræver ikke nogen eksogene stilladser materialer og specifikt organisere, således at epiteliale celler omfatter spheroid-lignende struktur og blive polariseret med stromale celler i midten, der producerer og udskiller kollagen. Østrogen, progesteron og androgenreceptorer er udtrykt i epitelial og stromale celler og behandling med fysiologiske niveauer af østrogen og testosteron fremme organiseringen af organoider. Dette nye model system kan bruges til at studere normal endometriecancer biologi og sygdom på måder, der ikke var muligt før.
Den menneskelige endometriet linjer livmoderhulen og fungerer som den første kontakt for embryonet under implantation. Endometriet består af luminale og glandulære epiteliale celler, støttende stromale fibroblaster, endotelceller og immunceller. Sammen, disse celletyper udgør den endometriale væv, som er en af de mest lydhør væv til sex steroid hormoner1. De ændringer, der opstår under hver menstruationscyklus er slående. Passende vækst og Remodeling af endometriet er nødvendig for at gøre det muligt for embryo implantation at forekomme. Afvigende respons på østrogen og progesteron kan resultere i en refraktær endometriet, der ikke giver mulighed for en vellykket etablering af graviditet og kan endda resultere i sygdomme, herunder endometriecancer neoplasi.
For at studere hormon respons og væsentlige ændringer, der opstår i endometriet, celler fra endometriale væv exciseret fra patienter under kirurgi eller endometriecancer biopsi er blevet formeret i cellekultur. Endometriale stromale celler fortrinsvis formere sig og udbrede let, og processen med differentiering induceret af progesteron kan rekapitulere in vitro. Som et resultat, meget er blevet lært i løbet af denne differentiering proces, kaldet decidualization2,3. Den anden store celletype i endometriet, luminale og glandulære epiteliale celler, dog ikke vokser godt som traditionelle monolayers, mister polaritet, bliver senescent, og har begrænset proliferativ potentiale. Som et resultat, mindre er kendt af deres biologi og deres rolle i den menneskelige endometrium. Da mange neoplasi stammer fra epitelialcellerne, er mekanismerne i forbindelse med hyperplasi eller omdannelse til kræftceller stadig fuldt definerede. Endvidere, undersøgelser har fastslået, at hormon respons involverer de intime paracrine handlinger mellem epiteliale og stromale celler i endometriet4,5.
For nylig blev en tredimensionel (3D) organoid kultur af endometriale epitelceller etableret af to uafhængige grupper6,7, som er de første rapporter af organoider dannet af endometriale væv. Disse organoider bestod af endometriale epiteliale celler indlejret i en protein matrix (tabel over materialer) og omfattede ikke et vigtigt hormonelt responsivt rum af endometriecancer endometrium, stromale fibroblaster. Da matrix proteinerne kan variere fra lot til Lot og kan udløse signalerings veje, der ikke nødvendigvis forekommer i vævet, ville det være ideelt at udskifte matrix proteinerne med komponenterne i endometriet. I den nuværende undersøgelse, en protokol til at generere stilladset-fri humane endometriale organoider af epitelial og stromale celler i den menneskelige endometriet er præsenteret. Tilstedeværelsen af stromale celler ikke kun giver støtte til epiteliale celler, men også giver de nødvendige paracrine handlinger, der er blevet etableret for at være vigtige for endometriale hormon respons4,8,9 .
Den nye multicellulære endometriale organoid tilbyder et model system af endometriet, der er enkel at generere, og som inkorporerer både epiteliale og stromale celler. Disse organoider kan bruges til at studere langsigtede hormonelle forandringer og tidlige hændelser af sygdom som tumor på grund af hormonel ubalance eller eksogene fornærmelser. Kompleksiteten af disse organoider kunne i sidste ende udvides til at omfatte andre celletyper, herunder endotelog immunceller med muligvis myometriale celler til virkelig efterligne humant væv fysiologi.
Vi har genereret humane endometriale organoider bestående af epiteliale og stromale celler i endometriet uden brug af eksogene stilladset materialer. Selv om det allerede er blevet påvist, at primære endometriale epitelceller kan danne organoider6,7, disse celler blev indlejret i en gelatinøse matrix af proteiner udskillet af mus sarkom celler (Se tabel over materialer) for at hjælpe form spheroid-lignende strukturer. Desuden var endometrial…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) og Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Vi vil gerne anerkende den nordvestlige patologi kerne facilitet til behandling af de faste organoider for paraffin indlejring. Vi vil gerne anerkende hele UG3-teamet, herunder Woodruff, Burdette og Urbanek Labs, for de indsigtsfulde diskussioner og samarbejder.
Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
Dispase | Corning | 354235 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |