Summary

Generation af flercellede humane primære Endometriale Organoider

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

En protokol til at generere humane primære endometriale organoider, der består af epiteliale og stromale celler og bevarer karakteristika af det indfødte endometrievæv præsenteres. Denne protokol beskriver metoder fra erhvervelse af uterin væv til histologisk behandling af endometriale organoider.

Abstract

Den menneskelige endometriet er en af de mest hormonelt lydhør væv i kroppen og er afgørende for etablering af graviditet. Dette væv kan også blive syg og forårsage sygelighed og endda død. Model systemer til undersøgelse af menneskets endometriebiologi har været begrænset til in vitro-kultur systemer af enkelt celletyper. Hertil kommer, at epiteliale celler, en af de store celletyper af endometrium, ikke udbrede godt eller bevare deres fysiologiske træk i kulturen, og dermed vores forståelse af endometriecancer biologi fortsat begrænset. Vi har for første gang genereret endometriale organoider, der består af både epiteliale og stromale celler i den menneskelige endometrium. Disse organoider kræver ikke nogen eksogene stilladser materialer og specifikt organisere, således at epiteliale celler omfatter spheroid-lignende struktur og blive polariseret med stromale celler i midten, der producerer og udskiller kollagen. Østrogen, progesteron og androgenreceptorer er udtrykt i epitelial og stromale celler og behandling med fysiologiske niveauer af østrogen og testosteron fremme organiseringen af organoider. Dette nye model system kan bruges til at studere normal endometriecancer biologi og sygdom på måder, der ikke var muligt før.

Introduction

Den menneskelige endometriet linjer livmoderhulen og fungerer som den første kontakt for embryonet under implantation. Endometriet består af luminale og glandulære epiteliale celler, støttende stromale fibroblaster, endotelceller og immunceller. Sammen, disse celletyper udgør den endometriale væv, som er en af de mest lydhør væv til sex steroid hormoner1. De ændringer, der opstår under hver menstruationscyklus er slående. Passende vækst og Remodeling af endometriet er nødvendig for at gøre det muligt for embryo implantation at forekomme. Afvigende respons på østrogen og progesteron kan resultere i en refraktær endometriet, der ikke giver mulighed for en vellykket etablering af graviditet og kan endda resultere i sygdomme, herunder endometriecancer neoplasi.

For at studere hormon respons og væsentlige ændringer, der opstår i endometriet, celler fra endometriale væv exciseret fra patienter under kirurgi eller endometriecancer biopsi er blevet formeret i cellekultur. Endometriale stromale celler fortrinsvis formere sig og udbrede let, og processen med differentiering induceret af progesteron kan rekapitulere in vitro. Som et resultat, meget er blevet lært i løbet af denne differentiering proces, kaldet decidualization2,3. Den anden store celletype i endometriet, luminale og glandulære epiteliale celler, dog ikke vokser godt som traditionelle monolayers, mister polaritet, bliver senescent, og har begrænset proliferativ potentiale. Som et resultat, mindre er kendt af deres biologi og deres rolle i den menneskelige endometrium. Da mange neoplasi stammer fra epitelialcellerne, er mekanismerne i forbindelse med hyperplasi eller omdannelse til kræftceller stadig fuldt definerede. Endvidere, undersøgelser har fastslået, at hormon respons involverer de intime paracrine handlinger mellem epiteliale og stromale celler i endometriet4,5.

For nylig blev en tredimensionel (3D) organoid kultur af endometriale epitelceller etableret af to uafhængige grupper6,7, som er de første rapporter af organoider dannet af endometriale væv. Disse organoider bestod af endometriale epiteliale celler indlejret i en protein matrix (tabel over materialer) og omfattede ikke et vigtigt hormonelt responsivt rum af endometriecancer endometrium, stromale fibroblaster. Da matrix proteinerne kan variere fra lot til Lot og kan udløse signalerings veje, der ikke nødvendigvis forekommer i vævet, ville det være ideelt at udskifte matrix proteinerne med komponenterne i endometriet. I den nuværende undersøgelse, en protokol til at generere stilladset-fri humane endometriale organoider af epitelial og stromale celler i den menneskelige endometriet er præsenteret. Tilstedeværelsen af stromale celler ikke kun giver støtte til epiteliale celler, men også giver de nødvendige paracrine handlinger, der er blevet etableret for at være vigtige for endometriale hormon respons4,8,9 .

Den nye multicellulære endometriale organoid tilbyder et model system af endometriet, der er enkel at generere, og som inkorporerer både epiteliale og stromale celler. Disse organoider kan bruges til at studere langsigtede hormonelle forandringer og tidlige hændelser af sygdom som tumor på grund af hormonel ubalance eller eksogene fornærmelser. Kompleksiteten af disse organoider kunne i sidste ende udvides til at omfatte andre celletyper, herunder endotelog immunceller med muligvis myometriale celler til virkelig efterligne humant væv fysiologi.

Protocol

Endometriale prøver blev indsamlet fra præmenopausale kvinder, der gennemgår rutinemæssig hysterektomi for godartede livmoder sygdomme på Northwestern University Prlokke kvinders Hospital, i henhold til en institutionel revision Board-godkendt protokol. Der blev indhentet skriftligt samtykke fra alle kvinder, som indgik i undersøgelsen. 1. fremstilling af Agopstået skimmelsvampe Før celle isolation påbegyndes, støbt og ækvibrere 1,5% agopstået mikro forme (tabel o…

Representative Results

En skematisk af protokollen er afbildet i figur 1. Uterin væv blev opnået fra kirurgi, efter at det blev undersøgt af patologer. Endometriecancer foring blev adskilt fra myometrium ved skrabning og endometrievævet blev enzymatisk fordøjet til celler som skitseret i protokollen. Epiteliale og stromale celler blev tilsat til mikrobrønde i de agopstået forme. Efter 7 dage i kulturen blev organoider behandlet med E og T i yderligere 7 − 14 dage. Til histologi…

Discussion

Vi har genereret humane endometriale organoider bestående af epiteliale og stromale celler i endometriet uden brug af eksogene stilladset materialer. Selv om det allerede er blevet påvist, at primære endometriale epitelceller kan danne organoider6,7, disse celler blev indlejret i en gelatinøse matrix af proteiner udskillet af mus sarkom celler (Se tabel over materialer) for at hjælpe form spheroid-lignende strukturer. Desuden var endometrial…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev finansieret af NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) og Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Vi vil gerne anerkende den nordvestlige patologi kerne facilitet til behandling af de faste organoider for paraffin indlejring. Vi vil gerne anerkende hele UG3-teamet, herunder Woodruff, Burdette og Urbanek Labs, for de indsigtsfulde diskussioner og samarbejder.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
check_url/kr/60384?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

View Video