Bakteriyel Solgunluk Hastalığının Basit Genetik Analizi için Ralstonia Solanacearum ile Aşılama Takip Domates Kökü Dönüşümü
Summary
Burada, bakteriyel solgunluk hastalığı nın incelenmesi için basit genetik analiz yapmak için Ralstonia solanacearum ile aşılama takip domates kökü dönüşümü için çok yönlü bir yöntem satMaktadır.
Abstract
Ralstonia solanacearum, tarım için önemli bir tehdit neden, bitki türlerinin geniş bir yelpazede enfekte olabilir yıkıcı bir toprak kaynaklı vasküler patojendir. Ancak, Ralstonia modeli önemli ölçüde bakteriyel bitki patojenleri içeren diğer modellere göre underexploreed, Arabidopsis Pseudomonas syringae gibi . Ralstonia ve bitki bitkileri arasındaki etkileşimi anlamayı hedefleyen araştırmalar, bakteriyel solgunluk hastalığına karşı mücadele etmek için sürdürülebilir çözümler geliştirmek için gereklidir, ancak şu anda yerli konak bitkilerdeki etkileşimin farklı bileşenlerini karakterize etmek için basit deneysel tahlillerin olmaması engellenmiştir. Bu senaryoda, biz domates Ralstonia enfeksiyonu genetik analizi gerçekleştirmek için bir yöntem geliştirdik, Ralstoniadoğal bir ev sahibi . Bu yöntem, domates köklerinin Agrobacterium rhizogenes-aracılıdönüşümüne dayanır ve bunu ralstonia toprak-ıslatma aşılaması ile ortaya çıkan bitkilerin, ilgi yapısını ifade eden dönüştürülmüş kökleri içeren aşılamaya dayanmaktadır. Kök dönüşüm testinin çok yönlülüğü, rnai aracılığında gen aşırı ekspresyonu veya gen susturma gerçekleştirmeyi sağlar. Kavramın bir kanıtı olarak, domates kökleri Nde SlCESA6 RNAi aracılı susturma Ralstoniadirenç verilen göstermek için bu yöntemi kullandı. Burada, genetik yaklaşımların bakteriyel solgunluk hastalığını nispeten kısa sürede ve küçük ekipman ve bitki büyüme alanı gereksinimleriyle anlamasını sağlayan bu yöntemi ayrıntılı olarak tanımlıyoruz.
Introduction
Ralstonia solanacearum, bakteriyel solgunluk hastalığının nedensel ajan, diğerleri arasında patates, domates, tütün, muz, biber ve patlıcan da dahil olmak üzere bitki türlerinin geniş bir yelpazede enfekte olabilir dünya çapında bir dağıtım ile yıkıcı bir toprak kaynaklı vasküler patojen, diğerleri arasında1,2. Ralstonia’nın neden olduğu verim kayıpları, çeşitlerin, iklimin, toprağın ve diğer faktörlere bağlı olarak domates, patates veya muz üretiminin %80-90’ına ulaşabilir3. Ancak, Ralstonia modeli, Pseudomonas syringae veya Xanthomonas sppgibi bakteriyel bitki patojenlerini içeren diğer modellere kıyasla oldukça az keşfedilmemiştir. Ayrıca, bitki-mikrop etkileşimleri en çalışmalar model bitki Arabidopsis thalianaodaklanmıştır. Bu modelleri kullanarak araştırma büyük ölçüde bitki-bakteri etkileşimleri anlayışımıza katkıda bulunmuş olsa da, onlar ekin bitkilerde bu etkileşimleri anlamak için mevcut gerekliliği ele almamıştır. Araştırma Ralstonia ve bitki bitkileri arasındaki etkileşimi anlamak için bakteriyel solgunluk hastalığı ile mücadele için sürdürülebilir çözümler geliştirmek için gerekli olan ancak şu anda etkileşimin farklı bileşenleri karakterize etmek için basit deneysel tahliller eksikliği engellenir. Özellikle, domates, Ralstoniaiçin doğal bir ev sahibi , dünya çapında ikinci en önemli bitkisel ürün ve hastalıkların bir bolluk etkilenir4, bakteriyel solgunluk hastalığı da dahil olmak üzere. Bu çalışmada, domatesralstonia enfeksiyonu genetik analizi gerçekleştirmek için kolay bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem agrobacterium rhizogenesdayanmaktadır -domates köklerinin aracılı dönüşümü, seçim marker olarak DsRed floresan kullanarak5, Ralstonia toprak sırılsıklam aşılama takip ortaya çıkan bitkilerin, dönüştürülmüş kökleri içeren ilgi inşa ifade içeren. Kök dönüşüm testinin çok yönlülüğü, rnai aracılığında gen aşırı ekspresyonu veya gen susturma gerçekleştirmeyi sağlar.
Bu yöntemin potansiyel bir sınırlama dönüştürülmeyen köklerin artık büyüme oluşur. Bu plazmid kullanılan durumlarda özellikle dönüştürülmüş köklerin seçimi sağlayan bir muhabir gen yoksun olduğu durumlarda önemlidir. Bu sorunu çözmek için, antibiyotik seçimine dayalı alternatif bir yöntem geliştirdik, bu da dönüşümsüz köklerin büyümesini engellerken, aynı yandan da antibiyotiğe dirençli dönüştürülmüş köklerin büyümesini sağladı. A. rhizogenes sürgünlerin dönüşümüne neden olmadığından, antibiyotiğe karşı duyarlıdırlar ve bu nedenle antibiyotik içeren ortamdan ayrı tutulmalıdırlar.
Ralstonia karşı bitki direnci iyi anlaşılamamasına rağmen, çeşitli raporlar bakteriyel solgunluk 6 gelişmiş direnç için hücre duvarı değişiklikleri ilişkili var66 ,7,8,9. Bu hücre duvarı değişiklikleri vasküler gelişimi etkilediği ileri sürülmüştür, bitki içinde Ralstonia yaşam tarzı için önemli bir yönü10. Arabidopsis thaliana selüloz sintazları CESA4, CESA7 ve CESA8 kodlama genlerde mutasyonlar ikincil hücre duvar bütünlüğünü bozan gösterilmiştir, Ralstoniagelişmiş direnç neden , Hangi ABA sinyalizasyon bağlı gibi görünüyor8. Bu nedenle, bizim yöntem için kavram kanıtı olarak, biz SlCESA6 RNAi aracılı gen susturma yapıldı(Solyc02g072240),ikincil bir hücre duvarı selüloz synthase, ve AtCESA8 ortolog (At4g18780). Ralstonia ile sonraki toprak sırılsıklam aşılama slCESA6 bakteriyel solgunluk belirtilerine karşı direnci ni artırdı gösterdi, Ralstonia hücre duvar aracılı direnç büyük olasılıkla domates korunmuş olduğunu düşündüren, ve domates kökleribakteriyel solgunluk direnci genetik analizi yürütmek için yöntemimizi doğrulayan. Burada, genetik yaklaşımların bakteriyel solgunluk hastalığını nispeten kısa sürede ve küçük ekipman ve bitki büyüme alanı gereksinimleriyle anlamasını sağlayan bu yöntemi ayrıntılı olarak tanımlıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum tarım için önemli bir tehdit oluşturmaktadır; ancak, tarımsal önemi doğal konakları ile etkileşimi hala diğer bakteriyel patojenler ile karşılaştırıldığında, özellikle bitki türlerinde kötü anlaşılmaktadır. Çoğu durumda, genetik analiz zaman ve giderleri genetik konak bitkiler değiştirmek için gerekli tarafından engellenir. Bu sorunu çözmek ve domateste R. solanacearum enfeksiyonunun genetik analizini kolaylaştırmak için, domates köklerini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Macho laboratuvarının tüm laboratuvar üyelerine yararlı tartışmalar için, alvaro López-García’ya istatistiksel tavsiyeler için ve Xinyu Jian’a bu çalışma sırasında teknik ve idari yardım için teşekkür ederiz. Biz floresan görüntüleme ile yardım için PSC Hücre Biyolojisi çekirdek tesisi teşekkür Bu çalışma Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelik Araştırma Programı (hibe XDB27040204), Şangay Merkezi Bitki Stres Biyolojisi (Çince) tarafından desteklendi Bilimler Akademisi) ve Çince 1000 Talents programı.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
References
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
