재건 미세 수술에서 허혈 재관류 손상의 연구를위한 전 임상 쥐 모델

모든 절차는 Jesús Usón 최소 침습 수술 센터의 윤리위원회와 유럽 법률에 근거한 지방 정부의 복지 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 수술 전 및 외과 준비 22-25 °C의 케이지에서 290-350g의 무게의 하우스 위스타 쥐는 음식과 물을 무료로 이용할 수 있습니다. 스트레스로 인한 문제를 예방하기 위해 수술 전 1주동안 적응합니다. 마취 유도 챔버에 쥐를 놓고 산소 5 분 (0.5-1 L / 분)을 전달하고 기화기를 사용하여 마취를 유도하기 위해 5 % 세보플루란을 전달합니다. 마취가 유도되면 챔버에서 쥐를 꺼내. 쥐에 흡입 안면 마스크를 놓고 마취를 유지하기 위해 2 %의 세보플루란의 유량을 제공합니다. 발가락 핀치에 대한 반응이 없는지 확인합니다. 각막 건조 와 손상을 방지하기 위해 눈 보호 연고를 사용합니다. 다음과 같이 전신 마취하에 동물을 모니터링하십시오: 직장 온도계(35.9-37.5°C)를 놓고 점막 색상을 확인하고 설치류 펄스 산소 측정기를 배치하여O2 포화도를 확인합니다(>95%) 심박수(250-450 bpm). 저체온증을 피하고 절차 후 마취 회복을 개선하기 위해 열 지지대 (전기 가열 패드 또는 순환 물 담요)를 사용하십시오. 적절한 수분을 유지하기 위해 따뜻한 피하 생리식염수 용액 5 mL을 주입하십시오. 진통 및 항염증제 (멜록시캄 1 mg / kg / 일) 및 예방 항생제 (enrofloxacin 7.5 mg / kg / 일) 피하 시전 및 수술 후 5 일 동안 제공하십시오. 동물의 복부 및 인과 부위를 면도하십시오. 국소 포비동 요오드를 바르고 70 % 에탄올을 바르습니다. 멸균 드레이프로 동물을 덮습니다. 2. 무료 피부 플랩 모델 수술 수술 마커를 사용하여, 복부 중간선과 6cm 측면 중 하나를 일치하는 3cm x 6cm 플랩을 그립니다. 다음으로, 6cm 중도 절개의 상부 및 하부에 복부의 중간선과 2개의 수직 3cm 절개에서 6cm 피부 절개를 한다. 디자인 된 3cm x 6cm 피부 플랩을 해부하려면 가위와 Adson 집게를 사용하여 피부의 이동성으로 인해 플랩 (메스가 아닌)을 올립니다. 부드럽게 해부를 돕고 풍부한 느슨한 결합 조직에 둘러싸인 상복부 혈통을 식별하기 위해 꼬리 영역으로 두개골 영역에서 플랩을 당깁니다. 플랩 페디클을 만지지 않고 해부하거나 선박 벽을 손상시키지 않도록 가능한 한 적게 출현을 파악하여 해부하십시오. 8/0 나일론 봉합사를 사용하여 근위 꼬리 대퇴 혈관, 측면 곡절 대퇴 혈관 및 사페누스 혈관을 합자에 의해 폐색하십시오. 이에 의해, 플랩의 관류는 대퇴 동맥에 의해 제공되고 피상적인 꼬리 상복부 동맥을 통해 직접 계속되며, 정맥 배수는 대퇴 정맥을 향한 피상적 인 꼬리 상복부 정맥에 의해 수행된다. 혈관 페디클을 클램프 한 다음 8 시간 허혈 기간을 시작하기 위해 잘라. 절차 중에 온도를 유지하기 위해 전기 담요를 사용합니다. 따뜻한 (25° C) 0.9 % 식염수 용액의 두 5 ml 주사는 피하 투여된다. 제 1 투여는 절차가 시작된 후 2 시간 후에 수행된다; 그리고 동물의 적절한 회복을 얻기 위해 절차의 끝에서 두 번째. 헤파린화된 식염수(100 U/mL)를 사용하여 플랩을 침투시키고 미세 순환에서 정체된 혈액을 제거합니다. 10/0 나일론 봉합사를 사용하여 미세 외과 적 해부학을 수행하십시오. 허혈8시간 후, 미세혈관 클램프를 제거하여 플랩을 레퍼퓨즈하고 아래에 설명된 바와 같이 혈관 개통을 확인한다. 3. 수술 중 평가 정맥과 동맥에 대한 수동 개통 테스트 (빈 및 리필 테스트)를 수행하십시오. 이렇게하려면 두 개의 미세 수술 집게를 사용하고, 해부학에 말단을 배치하고 착유를 수행하십시오. 먼저 해부학 사이트에 가장 가까운 집게를 놓습니다. 혈관 절편이 비워진 후에도 혈류가 계속되면 해부학은 특허입니다. 이동 시간 초음파 유량계 및 미세 수술 프로브를 사용하여 혈류를 평가합니다. 유량 프로브에 적합한 크기를 선택하려면 페디클 용기의 직경을 측정합니다.참고: 0.7 mm 유량 프로브는 0.4 mm에서 0.7 mm에 이르는 혈관을 측정 할 수 있습니다. 1.0 mm 유량 프로브는 0.7 mm에서 1.0 mm에 이르는 혈관을 측정 할 수 있습니다. 1.5mm 유량 프로브는 1.0mm에서 1.5mm에 이르는 용기를 측정할 수 있습니다. 유량 부피를 정량화하기 위해 유량 프로브의 초음파 감지 창(반사판과 트랜스듀서 사이)에 대상 용기를 배치합니다.참고: 프로브를 용기의 평면에 중립으로 고정하여 장력이나 당김을 피하십시오. 모든 막대가 디스플레이의 녹색임을 확인하여 음향 커플링의 품질을 확인합니다.참고: 좋은 음향 커플링을 얻기 어려운 경우 초음파 젤 또는 생리식염수 용액을 국소적으로 사용하십시오. 좋은 커플링이 이루어지고 용기가 장력 없이 음향 창에 놓이면 디스플레이의 기록 버튼을 클릭하여 데이터를 저장합니다.참고: 신뢰할 수 있고 정확한 측정을 얻으려면 파형 패턴을 지속적으로 반복할 수 있는지 확인하십시오. 폴리글리콜산(PGA) 4-0 흡수성 편조 봉합사(16mm 3/8 삼각형 바늘)를 사용하여 피부를 닫습니다. 봉합사의 일부가 수술 후 쥐에 의해 물린 경우 강도와 조직 위치를 유지하기 위해 간단한 중단 패턴을 사용합니다. 레이저 반점 대비 분석(LASCA)을 사용하여 플랩의 미세 순환을 평가합니다. 각 동물과 연구의 각 후속 에 대한 새로운 기록을 확인합니다. 이렇게 하려면 파일/새 기록을 클릭합니다. 새 창이 열리고 설치 패널이 표시됩니다. 그런 다음 프로젝트 이름, 제목, 연산자 및 기록 이름의 정보를 편집합니다. 재현성을 극대화하기 위해 작동 거리, 측정 영역, 포인트 밀도, 프레임 속도 및 주변 광 조건과 같은 매개 변수를 표준화합니다. 조직과 관련하여 레이저를 이동하여 작동 거리를 조정합니다. 레이저 헤드를 관심 있는 조직쪽으로 확대 또는 축소합니다. 측정된 값을 확인하려면 이미지 설정을클릭합니다. 이쪽은 12.0 cm로 설정되어 있습니다. 이미지 설정에서 원하는 너비와 높이를 입력하여 측정 영역을 표준화합니다. 디자인 된 플랩은 3cm x 6cm를 측정합니다. 이 측정을 위해 너비 4.0cm와 높이 7.0cm를 선택하여 여유 공간을 확보합니다. 이미지 설정에서 점 밀도를 높게 설정합니다. 높음, 중간 및 낮음은 세 가지 옵션입니다. 이미지 캡처 설정에서 레코딩의 프레임 속도(10개 이미지/s)와 레코딩의 지속 시간(1분)을 선택합니다.참고: 수술을 하거나 평가를 수행하는 동안 수술실에서 동일한 주변 광 상태를 가지고 있습니다. 녹음 단추를 클릭하여 녹화를 시작합니다. 설치 패널이 기록 패널로 대체됩니다. 데이터가 자동으로 저장됩니다. 추가 비교를 가능하게 하기 위해 프로시저 중에 스냅숏을 만듭니다.참고: 관류 스케일을 변경하여 시각화를 개선할 수 있습니다(도구 클릭 | 필터 및 컬러 스케일 | 관류 스케일 | 수동 0 – 150)하지만 측정된 관류 값은 영향을 받지 않습니다. 기록 전후에 다양한 관심 영역(ROI)을 만들어 그 내의 관류를 측정할 수 있습니다. 여기서, 연습된 플랩(3 cm x 6cm)의 면적만을 평가하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 생존 및 괴사 영역을 측정합니다. 플랩 의 측면에 있는 눈금자를 찾은 다음 플랩 생존 영역의 거시적 측정을 위해 제어 사진을 찍습니다. 사진을 평가하려면 ImageJ 사용자 인터페이스를 엽니다. 파일을 클릭하고 측정할 이미지를 엽니다. 도구 상자에서 직선을 선택하고 눈금자의 1cm 위에 직선을 그립니다. 분석 |을 클릭합니다. 배율을 설정하고 알려진 거리 1cm의 값에 대한 텍스트 상자에 소개합니다. 다각형 선택 도구를 클릭하고 플랩 위에 다각형 선을 그려 실행 가능한 영역을 계산합니다. 궁극적으로, 클릭 분석 | 면적 값을 얻기 위해 측정합니다. 수술 부위의 자가 절단을 방지하기 위해 하우징 전에 동물에 수술 후 드레싱을 놓습니다. 절차가 끝나면 동물은 온도 조절이있는 실 (22 ° C ~ 25 ° C)의 케이지에 개별적으로 보관됩니다. 4. 수술 후 평가 및 조직 샘플링 이 프로토콜에 앞서 설명된 동일한 단계를 수행하여 플랩 평가 및 조직 샘플링을 위한 7수술 후 일에서 랫트(1.2 단계 및 1.3단계)에 랫트체를 마취시다. 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오. 플랩 생존 및 괴사 영역의 거시적 측정을 가능하게하는 수술 영역을 촬영합니다. 프로토콜(3.5단계)에서 이전에 설명된 수술 중 평가의 동일한 단계를 따라 수술 후 거시적 측정을 수행합니다.참고: 다각형 선택 도구를 사용하는 동안 실행 가능한 영역을 구분하는 플랩에 선을 그려서 주의하십시오(cm2로 측정). 실행 가능한 영역의 백분율은 (총 플랩 면적의 가능한 영역 /cm2의 cm2) × 100으로 계산할 수 있습니다. LASCA 기법(3.4단계)을 사용하여 플랩의 미세 순환을 평가하여 관류 차이를 시각화하고 정량화합니다. 거시적 분석 후, 4/0 봉합사를 제거하고 플랩을 상승시켜 통과 시간 초음파를 사용하여 혈관 과실 혈류를 재평가하십시오. 플랩을 1.5 cm x 6 cm의 두 부분으로 세로로 나누어 조직 샘플링을 수행합니다. 추가 조직학적 분석을 위해 실온에서 4% 파라포름알데히드가 있는 생검 용기에 한 부분을 담그고 있습니다. 조직의 다른 부분을 동결 보존 튜브에 도입하고 액체 질소에 담근 다음 향후 분자 분석을 위해 -80 °C에 저장하여 튜브를 냉동 보존합니다. 윤리위원회의 권고에 따라 2 M KCl /kg의 빠른 심장 주사를 사용하여 일반 흡입 마취하에 쥐를 안락사시.