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의학

Un modèle préclinique de rat pour l'étude des dommages d'ischémie-réperfusion dans la microchirurgie reconstructive

Published: November 08, 2019
doi:
10.3791/60292
, , , , , , , ,
1Department of Microsurgery,Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre, 2Stem Cell Therapy Unit,Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre, 3Animal Modelling Unit,Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre

Summary

Ici, nous décrivons un modèle animal préclinique pour étudier la pathophysiologie des dommages d’ischémie-reperfusion dans la microchirurgie reconstructive. Ce modèle libre d’aileron de peau basé sur les vaisseaux épigastriques caudaux superficiels dans le rat peut également permettre l’évaluation de différentes thérapies et composés pour contrecarrer des dommages liés aux dommages liés aux dommages liés aux dommages liés aux dommages liés aux dommages liés aux dommages liés aux dommages liés aux dommages liés aux dommages liés aux blessures d’ischémie-reperfusion.

Abstract

Les dommages de ischémie-reperfusion sont la cause principale de l’échec d’aileron dans la microchirurgie reconstructive. Le rat est le modèle animal préclinique préféré dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale en raison de son rapport coût-efficacité et de sa traduction à l’homme. Ce protocole décrit une méthode pour créer un modèle libre préclinique d’aileron de peau chez les rats avec des dommages de ischémie-reperfusion. Le modèle décrit de 3 cm x 6 cm de rabat de peau libre de rat est facilement obtenu après le placement de plusieurs ligatures vasculaires et de la section du pédicle vasculaire. Puis, 8 h après l’insulte ischémique et l’achèvement de l’anastomose microchirurgicale, l’aileron de peau libre développe les dommages de tissu. Ces dommages liés aux blessures liées à l’ischémie-réperfusion peuvent être étudiés dans ce modèle, ce qui en fait un modèle approprié pour évaluer les agents thérapeutiques pour aborder ce processus pathophysiologique. En outre, deux techniques principales de surveillance sont décrites dans le protocole pour l’évaluation de ce modèle animal : la technologie d’ultrason de transit-temps et l’analyse de contraste de tache de laser.

Introduction

La microchirurgie est devenue une technique chirurgicale courante pour la reconstruction qui permet des interventions (par exemple, transferts de tissus libres) pour restaurer les défauts tissulaires complexes, la replantation des membres amputés, et même les allotransplantations de tissus composites.

Les reconstructions microchirurgicales sont idéales pour une grande variété de défauts provoqués par des dommages traumatiques, des brûlures, ou des résections oncologiques. Cependant, il y a un faible pourcentage de défaillance des ailerons libres, parmi lesquels les blessures à l’ischémie-réperfusion (I/R) sont l’un des principaux facteurs responsables. Tous les tissus microchirurgicalement transférés endurent une période obligatoire d’ischémie suivie de la reperfusion. Cette période d’ischémie primaire est habituellement bien tolérée ; ainsi, le taux de réussite des procédures microchirurgicales dépasse 90%1,2. Cependant, seulement 63,7% des volets nécessitant une révision chirurgicale peuvent être complètement sauvés3. En outre, en cas de replantation de blessures d’avulsion des doigts, le taux de réussite est de 66 %4; et dans les cas d’allotransplantation de tissu composite souffrant de blessures I/R, les pourcentages de rejet sont augmentés puisque la blessure I/R active l’immunité innée5,6.

Par conséquent, l’étude de ce phénomène pathophysiologique est d’intérêt. Les modèles animaux sont essentiels pour étudier les mécanismes physiologiques et évaluer de nouvelles thérapies avant qu’elles puissent être appliquées aux humains7. L’anatomie des vaisseaux et les similitudes physiologiques entre les rats et les êtres humains font des rats un modèle idéal pour l’étude de processus biologiques tels que les lésions I/R.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la création d’un modèle sans rat d’aileron de peau avec des dommages de I/R, aussi bien que différentes possibilités pour des évaluations intra- et postopératoires. L’objectif global de cette méthode est de décrire un modèle préclinique utile pour étudier les blessures I/R et les traitements possibles pour réduire ses dommages connexes.

Protocol

Toutes les procédures ont été menées conformément au comité d’éthique du Centre de chirurgie mini-invasive de Jess Uson et aux lignes directrices du gouvernement régional en matière de bien-être qui sont fondées sur la législation européenne. 1. Préparation préchirurgicale et chirurgicale Maison rats Wistar pesant 290 à 350 g dans des cages à 22-25 oC avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Acclimatez-vous pendant 1 semaine avant la chirurgie pour prévenir les problèmes causés par le stress. Placer un rat dans une chambre d’induction anesthésique, délivrer 5 min d’oxygène (0,5-1 L/min), et utiliser un vaporisateur pour délivrer 5% de sevoflurane pour induire l’anesthésie. Sortez le rat de la chambre une fois l’anesthésie induite. Placez le masque d’inhalation sur le rat et fournissez un débit de 2% de sevoflurane pour maintenir l’anesthésie. Vérifiez l’absence de réponse à une pincée d’orteil. Utilisez une pommade de protection oculaire pour prévenir le séchage et les dommages cornéens. Surveillez l’animal sous anesthésie générale comme suit : Placez un thermomètre rectal (35,9 à 37,5 oC), vérifiez la couleur de la muqueuse et placez un oxymètre d’impulsion de rongeur pour vérifier la saturation de l’O2 (à 95 %) fréquence cardiaque (250 à 450 bpm). Utilisez un support thermique (coussinets chauffants électriques ou couvertures d’eau en circulation) pour éviter l’hypothermie et améliorer la récupération de l’anesthésie post-procédurale. Injecter 5 ml de solution saline physiologique sous-cutanée chaude pour maintenir une bonne hydratation. Fournir des analgésiques et anti-inflammatoires (méloxicam 1 mg/kg/jour) et des antibiotiques prophylactiques (enrofloxacine 7,5 mg/kg/jour) sous-cutané avant l’intervention et pendant 5 jours postopératoirement. Raser les zones abdominales et inguinales de l’animal. Appliquer du povidone-iode topique, suivi de 70% d’éthanol. Couvrir l’animal d’un drapé stérile. 2. Chirurgie gratuite de modèle de rabat de peau À l’aide d’un marqueur chirurgical, dessiner un rabat de 3 cm x 6 cm correspondant à l’un des côtés de 6 cm avec la ligne médiane de l’abdomen. Ensuite, faire une incision cutanée de 6 cm à la ligne médiane de l’abdomen et deux incisions perpendiculaires de 3 cm à la partie supérieure et inférieure de l’incision médiane de 6 cm. Pour commencer à disséquer le rabat de peau conçu de 3 cm x 6 cm, utilisez des ciseaux et des forceps Adson pour soulever le rabat (plutôt qu’un scalpel) en raison de la mobilité de la peau. Tirez doucement le rabat de la zone crânienne vers la zone caudale pour aider à la dissection et identifier le pédicle épigastrique entouré par le tissu conjonctif lâche abondante. Disséquez le pédicle des volets sans le toucher ou en saisissant l’aventitia le moins possible pour éviter d’endommager le mur du navire. Utilisez 8/0 sutures en nylon pour occluder en ligatures les vaisseaux fémoraux caudaux caumal s’enclenciels, les vaisseaux fémoraux circonflexes latéraux et les vaisseaux saphenous. Par conséquent, la perfusion de l’aileron est fournie par l’artère fémorale et continue directement par l’artère épigastrique caudale superficielle, tandis que le drainage veineux est exécuté par la veine épigastrique caudale superficielle vers la veine fémorale. Clamp le pédicle vasculaire, puis le couper pour commencer la période d’ischémie de 8 h. Pendant la procédure, utilisez des couvertures électriques pour maintenir la température. Deux injections de 5 ml de solution saline chaude (25 oC) de 0,9 % sont administrées sous-cutanée. La première administration est effectuée 2 h après le début de la procédure; et le second à la fin de la procédure pour obtenir un rétablissement approprié de l’animal. Utilisez une solution saline héparinisée (100 U/mL) pour perséviser le rabat et retirer le sang stagnant de la microcirculation. Utilisez 10/0 sutures en nylon pour effectuer les anastomoses microchirurgicaux. Après 8 h d’ischémie, réperfusez le rabat en enlevant les pinces microvasculaires et vérifiez la patency vasculaire comme décrit ci-dessous. 3. Évaluation peropératoire Effectuez un test manuel de patency (test de vide et de recharge) pour la veine et l’artère. Pour ce faire, utilisez deux forceps microchirurgicaux, placez-les distal à l’anastomose et effectuez la traite. Relâchez d’abord les forceps les plus proches du site d’anastomose. Si le flux sanguin continue après qu’une section vasculaire soit vidée, alors l’anastomose est brevetée. Évaluez le flux sanguin à l’aide d’un débitmètre à ultrasons en temps de transit et de sondes microchirurgicales. Mesurer le diamètre des vaisseaux pédicles afin de choisir la taille appropriée pour les sondes d’écoulement.REMARQUE: Une sonde à débit de 0,7 mm peut mesurer des navires allant de 0,4 mm à 0,7 mm; une sonde à débit de 1,0 mm peut mesurer des navires allant de 0,7 mm à 1,0 mm; une sonde de débit de 1,5 mm peut mesurer des navires allant de 1,0 mm à 1,5 mm. Placez le vaisseau cible dans la fenêtre de détection à ultrasons (entre le réflecteur et les transducteurs) de la sonde d’écoulement pour quantifier le volume d’écoulement.REMARQUE: Maintenez la sonde neutre au plan du navire, afin d’éviter toute tension ou traction. Vérifiez la qualité du couplage acoustique en observant que toutes les barres sont vertes sur l’écran.REMARQUE: S’il est difficile d’obtenir un bon couplage acoustique, utilisez un gel à ultrasons ou une solution saline physiologique topique. Lorsque le bon couplage est réalisé et que le navire est placé dans la fenêtre acoustique sans aucune tension, cliquez sur le bouton Enregistrement sur l’écran pour stocker les données.REMARQUE: Pour obtenir une mesure fiable et correcte, assurez-vous que le modèle de forme d’onde est constamment répétable. Une fois fait, utilisez l’acide polyglycolique (PGA) 4-0 sutures tressées absorbables (16mm 3/8 aiguille triangulaire) pour fermer la peau. Utilisez un modèle interrompu simple pour maintenir la force et la position de tissu si une partie de la suture est mordue par le rat postopératoirement. Évaluer la microcirculation du volet à l’aide de l’analyse du contraste des taches laser (LASCA). Faire un nouvel enregistrement pour chaque animal et pour chaque suivi de l’étude. Pour cela, cliquez sur Fichier /Nouvel enregistrement. Une nouvelle fenêtre s’ouvre et le panneau de configuration s’affiche. Modifiez ensuite les informations du nom du projet, du sujet, de l’opérateur et du nom d’enregistrement. Pour une reproductibilité maximale, normalisez les paramètres suivants : distance de travail, zone de mesure, densité de points, fréquence d’image et conditions de lumière ambiante. Ajuster la distance de travail en déplaçant le laser par rapport au tissu. Zoom ezoue ou sortait de la tête laser vers le tissu d’intérêt. Pour vérifier la valeur mesurée, cliquez sur Image Setup. Ici, fixé à 12,0 cm. Normaliser la zone de mesure en entrant la largeur et la hauteur souhaitées à la configuration de l’image. Le volet conçu mesure 3 cm x 6 cm. Pour cette mesure, sélectionnez une largeur de 4,0 cm et une hauteur de 7,0 cm pour avoir un peu plus d’espace. Définir la densité de points aussi haut dans la configurationd’image . Les trois options sont élevées, moyennes et basses. Lors de la configuration de capture d’image, sélectionnez le taux de trame (10 images/s) pour l’enregistrement et la durée (1 min) de l’enregistrement.REMARQUE: Avoir la même condition de lumière ambiante dans la salle de chirurgie tout en opérant ou en effectuant les évaluations. Cliquez sur le bouton Enregistrement pour commencer à enregistrer. Le panneau d’configuration est remplacé par le panneau d’enregistrement. Les données sont enregistrées automatiquement. Prenez des instantanés au cours de la procédure pour permettre une comparaison plus approfondie.REMARQUE: L’échelle de perfusion peut être modifiée pour améliorer la visualisation (Cliquez sur Outils Filtres et échelles de couleurs Échelle de perfusion Manuel 0 – 150), mais les valeurs de perfusion mesurées ne seront pas affectées. Avant et après l’enregistrement, différentes régions d’intérêt (ROI) peuvent être créées pour mesurer la perfusion en leur sein. Ici, nous avons évalué seulement la zone du rabat pratiqué (3 cm x 6 cm). Utilisez le logiciel ImageJ pour mesurer la survie et les zones de nécrose. Localisez une règle sur le côté de l’aileron, puis prenez des photos de contrôle pour les mesures macroscopiques de la zone de survie des volets. Pour évaluer les images, ouvrez l’interface utilisateur ImageJ. Cliquez sur Fichier et Ouvrez l’image à mesurer. Sélectionnez Straight Line à la boîte à outils et tracez une ligne droite sur 1 cm de la règle. Cliquez sur Analyser (fr) Définir l’échelle et introduire dans la boîte de texte pour la distance connue la valeur de 1 cm. Cliquez sur l’outil de sélection du polygone et dessinez les lignes de polygone sur le rabat pour calculer la zone viable. En fin de compte, cliquez sur Analyze Mesure pour obtenir la valeur de la zone. Placez un pansement postopératoire sur l’animal avant de le loger pour éviter l’automutilation de la zone chirurgicale. Après les procédures, les animaux sont logés dans des cages individuellement, dans une pièce avec contrôle de la température (22 à 25 oC). 4. Évaluation postopératoire et échantillonnage tissulaire Anesthésiez le rat à 7 jours postopératoires pour l’évaluation des ailerons et l’échantillonnage des tissus en suivant les mêmes étapes précédemment décrites dans ce protocole (étapes 1.2 et 1.3). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse à la pincée d’orteil. Photographiez la zone chirurgicale pour permettre des mesures macroscopiques de la survie des ailerons et des zones de nécrose. Faire les mesures macroscopiques postopératoires suivant les mêmes étapes de l’évaluation peropératoire qui ont été expliquées précédemment dans le protocole (étape 3.5).REMARQUE: Faites attention en utilisant l’outil de sélection du polygone en dessinant les lignes sur le rabat délimitant la zone viable (mesurée en cm2). Le pourcentage de la zone viable peut être calculé comme (cm2 de la zone viable/cm2 de la surface totale des volets) à 100. Évaluer la microcirculation du volet à l’aide de la technique LASCA (étape 3.4) pour visualiser et quantifier les différences de perfusion Après l’analyse macroscopique, retirez les sutures 4/0 et soulevez le rabat pour réévaluer le flux sanguin vasculaire de pédicle en utilisant l’ultrason de transit-temps. Effectuer l’échantillonnage des tissus en divisant longitudinalement le rabat en deux parties de 1,5 cm x 6 cm. Immerger une partie dans un récipient de biopsie avec 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pour d’autres analyses histologiques. Introduire l’autre partie du tissu dans un tube de cryoconservation, l’immerger dans de l’azote liquide et ensuite, cryoconserver le tube en le stockant à -80 oC pour de futures analyses moléculaires. Euthanasier le rat sous anesthésie par inhalation générale à l’aide d’une injection intracardiaque rapide de 2 M KCl/kg selon les recommandations du comité d’éthique.

Representative Results

Immédiatement après la création de l’anastomoses microchirurgical, nous avons obtenu des volumes de flux sanguin sain plus élevés que les flux minimaux recommandés dans la littérature8; ainsi, tous les anastomoses microchirurgicaux étaient brevetés 1 semaine après la chirurgie (Figure 1). Figure 1 : Évaluation du débit sanguin par ultrasons en temps de transit. (A) Position de la sonde de flux microchirurgical pour évaluer le flux sanguin. (B) Modèle de flux sanguin et quantification obtenu des vaisseaux anastomosed du pédicle d’aileron. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. L’observation de la privation microcirculatoire du flux sanguin pendant l’insulte ischémique était possible avec la technique de LASCA, y compris l’hyper perfusion immédiate pendant la réperfusion d’aileron, et, perioperatively, les différentes zones avec moins de perfusion et un plus grand risque de nécrose postopératoire d’aileron qui étaient en effet nécrose 7 jours après la fin de l’étude (figure 2). Figure 2 : Technologie d’analyse de contraste de tache laser. (A) Visualisation de la perfusion de sang de tissu microcirculatoire dans l’état physiologique. (B) Visualisation de la perfusion sanguine des tissus microcirculatoires pendant l’ischémie. (C) Visualisation de la perfusion de sang de tissu microcirculatoire immédiatement après la reperfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. La zone de survie d’aileron après 8 h de l’ischémie et sa reperfusion suivante était autour de 40%. Les résultatspubliés précédemment 9 ont montré des différences statistiquement significatives lorsque ce modèle a été comparé à des volets où aucune insulte ischémique n’a été infligée.

Discussion

Les transferts de tissus libres microchirurgicaux sont devenus la méthode de choix pour reconstruire de grands défauts. Une période d’ischémie se produit pendant de tels transferts libres de tissu. Lorsque cette période dépasse la tolérance du tissu, les blessures I/R peuvent causer une défaillance du rabat libre pratiqué9. La description de la méthodologie pour développer un modèle préclinique rentable et translationnel pour étudier les lésions I/R en microchirurgie reconstructive peut aider à mener l’étude de différents composés pour contrecarrer ce processus pathophysiologique.

Dans le modèle animal décrit, après que les ligatures vasculaires aient été placées et que l’aileron libre ait été soulevé, aucun compromis de flux sanguin de membre postérieur n’a été noté, ni douleur ou boiterie. Comme Kochi et coll.10 l’ont décrit, notre modèle a également laissé trois voies collatérales par le biais de réseaux intramusculaires.

La surveillance des volets libres est d’une importance majeure11, car le sauvetage est inversement lié à la durée entre l’inset d’ischémie et sa reconnaissance clinique. À cette fin, les volets libres doivent être étudiés intra- et postopératoirement.

Peropératoirement, le test de vidange et de recharge largement utilisé ou le Doppler acoustique permettent d’identifier mais pas de quantifier la présence ou l’absence du débit par anastomose12. Pour cette raison, nous avons utilisé la technologie d’échographie en temps de transit, une nouvelle méthode qui permet aux chirurgiens de quantifier le flux sanguin de l’anastomoses microchirurgical13. Dans notre étude, tous les anastomoses microchirurgicaux étaient patents après 8 h d’insulte ischémique aussi bien qu’à la fin de l’étude. Immédiatement après la création de l’anastomoses microchirurgical, nous avons noté des volumes de flux sanguin plus élevés que les minimums recommandés dans la littérature8. Ceci a prévu la perfusion bonne de pédicle à la fin de l’étude, démontrant que les résultats n’ont pas été influencés par la technique microchirurgicale mais plutôt par la cascade d’événements de blessure d’I/R. Cependant, cette technique n’est pas exempte de limitations. Pour obtenir des résultats fiables, les sondes microchirurgicales doivent être maintenues neutres par avion du navire, sans le tirer ni créer de tension. Un bon couplage acoustique est nécessaire pour obtenir un signal approprié, qui peut être réalisé à l’aide de gel à ultrasons ou salin. Un signal de couplage de haute qualité, fourni par l’équipement, est un paramètre important à prendre en compte lors des mesures.

Nous avons utilisé LASCA, également connu sous le nom d’imagerie de contraste de tache de laser ou d’imagerie de tache de laser, postopératoirement14. Cette technologie représente une technique précieuse pour la cartographie semi-quantitative en temps réel du flux dans les volets libres tel que vérifié ici. L’une des limites est que les résultats sont fournis dans des unités arbitraires et ne sont pas directement liés aux valeurs de flux réelles. En ce sens, d’autres recherches sont nécessaires pour valider cette corrélation. La fluidité de Doppler laser est plus couramment utilisée mais limitée par le fait qu’elle mesure seulement la perfusion dans un seul point dans le rabat, alors que LASCA permet la détection des changements régionaux dans la perfusion de peau dans le rabat15. En outre, une étude récente16 a indiqué que LASCA peut prévoir perioperatively les régions à haut risque de nécrose postopératoire d’aileron. Nos résultats suggèrent que LASCA est une technique prometteuse pour la surveillance péri- et postopératoire des volets libres.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le projet de recherche a été réalisé au Centre de chirurgie mini-invasive (CCMIJU), une partie de l’ICTS Nanbiosis. L’étude a été réalisée avec l’aide des unités de Nanbiosis suivantes : U21, salle d’opération expérimentale ; U22, logement pour animaux; et U14, thérapie cellulaire. Ce travail a été soutenu par le projet PI16/02164 de l’ISCIII. Le bailleur de rôle n’a joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Un merci spécial à Maria Pérez pour la préparation des figures et à Fernanda Carrizosa pour avoir fourni un encouragement constant et soutenu la bibliographie scientifique.

Materials

AureFlo Unit Transonic (Ithaca, USA) N/A Transit-time ultrasound flowmeter equipment
Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) S&T AG (Neuhausen, Switzerland) RHR-SET. Art.No.00795 Set of microsurgical instruments
FLOW-i Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) N/A Anesthesia Delivery System
Micro clamps ABB-1 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00408V Double microvascular clamp with frame
Micro clamps ABB-11 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00414V Double microvascular clamp without frame
Micro clamps B-1 S&T AG (Neuhausen, Switzerland) 00396V Sigle microvascular clamp
Nylon suture 10/0 Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) 19921 Microsurgical suture
OPMI Pentero 800 Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) N/A Surgical microscope
PeriCam PSI System Perimed AB (Järfälla, Sweden) N/A Laser speckle contrast analysis equipment
Philips Intellivue MX450 Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) N/A Monitoring system
Protector posoperatorio para roedores Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) P201400272 Postoperative protector for rodents
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References

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Ballestín, A., Casado, J. G., Abellán, E., Vela, F. J., Campos, J. L., Martínez-Chacón, G., Bote, J., Blázquez, R., Sánchez-Margallo, F. M. A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery. J. Vis. Exp. (153), e60292, doi:10.3791/60292 (2019).
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