Een pre-klinische rat model voor de studie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie
Summary
Hier beschrijven we een pre-klinisch diermodel voor het bestuderen van de pathofysiologie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie. Dit gratis Skin flap model op basis van de oppervlakkige caudal epigastrische vaten in de rat kan ook de evaluatie van verschillende therapieën en verbindingen mogelijk maken om schade door ischemie-reperfusie letsel te neutraliseren.
Abstract
Ischemie-reperfusie letsel is de belangrijkste oorzaak van klep falen in reconstructieve microchirurgie. De rat is het voorkeur preklinisch diermodel op vele gebieden van biomedisch onderzoek vanwege de kosteneffectiviteit en de vertaling ervan naar de mens. Dit protocol beschrijft een methode om een preklinisch vrij huid flap model te creëren bij ratten met ischemie-reperfusie letsel. Het beschreven 3 cm x 6 cm rat vrije huid flap model is gemakkelijk te verkrijgen na de plaatsing van verschillende vasculaire ligaturen en het gedeelte van de vasculaire pedile. Dan, 8 h na de ischemische belediging en voltooiing van de microchirurgische anastomose, de vrije huid flap ontwikkelt de weefselbeschadiging. Deze letsel-gerelateerde schade aan ischemie-reperfusie kan in dit model worden bestudeerd, waardoor het een geschikt model is voor de evaluatie van therapeutische middelen om dit pathofysiologisch proces aan te pakken. Bovendien worden twee belangrijke bewakingstechnieken beschreven in het protocol voor de beoordeling van dit diermodel: transittijd echografie en laserspikkel contrast analyse.
Introduction
Microchirurgie is uitgegroeid tot een gemeenschappelijke chirurgische techniek voor reconstructie die het mogelijk maakt voor interventies (bv. vrije weefsel overdrachten) om complexe weefsel defecten te herstellen, replantation van geampuleerde ledematen, en zelfs samengestelde weefsel allotransplantaties.
Microchirurgische reconstructies zijn ideaal voor een breed scala aan defecten veroorzaakt door traumatische verwondingen, brandwonden of oncologische resecties. Echter, er is een laag percentage van de vrije flap falen, waaronder ischemie-reperfusie (I/R) letsel is een van de belangrijkste verantwoordelijke factoren. Alle microchirurgisch overgedragen weefsels doorstaan een verplichte periode van ischemie gevolgd door het reperfusie. Deze periode van primaire ischemie wordt meestal goed verdragen; het succespercentage van de microchirurgische ingrepen overschrijdt dus 90%1,2. Slechts 63,7% van de kleppen die een chirurgische revisie vereisen, kan echter volledig worden opgeslagen3. Bovendien, in gevallen van herplantage van vinger avulsion verwondingen, het succespercentage is 66%4; en in gevallen van samengestelde weefsel allotransplantatie lijden I/r letsel, afwijzings percentages worden verhoogd sinds de I/r letsel activeert aangeboren immuniteit5,6.
Daarom is de studie van dit pathofysiologisch fenomeen van belang. Diermodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van fysiologische mechanismen en het beoordelen van nieuwe therapieën voordat het kan worden toegepast op mensen7. De anatomie van het vaartuig en de fysiologische gelijkenissen tussen ratten en mensen maken ratten tot een ideaal model voor het onderzoek van biologische processen zoals I/R-letsel.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de creatie van een rat Free Skin flap model met I/R letsel, evenals verschillende mogelijkheden voor intra-en postoperatieve evaluaties. Het algemene doel van deze methode is om een nuttig preklinisch model te beschrijven om I/R-letsel en mogelijke behandelingen te bestuderen om de bijbehorende schade te verminderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microchirurgische vrije weefsel overdrachten zijn uitgegroeid tot de methode van keuze voor het reconstrueren van grote gebreken. Een periode van ischemie optreedt tijdens dergelijke vrije weefsel overdrachten. Wanneer deze periode de tolerantie van het weefsel overschrijdt, kan I/R-letsel falen van de geoefende vrije flap9veroorzaken. De beschrijving van de methodologie om een kostenbesparend en translationeel preklinisch model te ontwikkelen om I/R-letsel in reconstructieve microchirurgie te bestuderen, kan bijdragen aan de studie van verschillende verbindingen om dit pathofysiologisch proces tegen te gaan.
In het diermodel beschreven, nadat de vasculaire ligaturen werden geplaatst en de vrije flap werd verhoogd, geen hindledemaat bloedstroom compromissen werden opgemerkt, noch pijn of slap. Zoals Kochi et al.10 beschreef, liet ons model ook drie neven routes door intramusculaire netwerken.
Bewaking van vrije kleppen is van groot belang11, als berging is omgekeerd gerelateerd aan de duur tussen ischemie begin en de klinische herkenning. Voor dit doel moeten vrije kleppen intra-en postoperatief worden bestudeerd.
Intra-operatief, de veelgebruikte lege en navul test of de akoestische Doppler maken identificatie mogelijk, maar niet kwantificering van stroom aanwezigheid of afwezigheid via een anastomose12. Om deze reden gebruikten we de transit-time echografie-technologie, een nieuwe methode waarmee chirurgen de bloedtoevoer van microchirurgische anastomosen13kunnen kwantificeren. In onze studie, alle microchirurgische anastomosen waren patent na 8 h van ischemische belediging en aan het einde van de studie. Onmiddellijk na de oprichting van de microchirurgische anastomoses, merkten we hogere bloedstroom volumes dan de minima aanbevolen in de literatuur8. Dit voorspelde goede pedile perfusie aan het einde van de studie, waaruit blijkt dat de resultaten niet werden beïnvloed door de micro-chirurgische techniek, maar eerder door de I/R blessure cascade van gebeurtenissen. Deze techniek is echter niet vrij van beperkingen. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, moeten de microchirurgische voelers neutraal worden gehouden voor het vlak van het vat, niet trekken of spanning creëren. Een goede akoestische koppeling is nodig om een goed signaal te verkrijgen, dat kan worden bereikt met behulp van ultrasone gel of zoutoplossing. Een kwalitatief hoogwaardig koppelings signaal, dat door de apparatuur wordt geleverd, is een belangrijke parameter die tijdens de metingen moet worden overwogen.
We hebben LASCA gebruikt, ook wel bekend als laser spikkel contrast Imaging of laser spikkel Imaging, postoperatief14. Deze technologie vertegenwoordigt een waardevolle techniek voor semi-kwantitatieve real-time mapping van Flow binnen vrije kleppen zoals hier geverifieerd. Een van de beperkingen is dat de resultaten worden geleverd in willekeurige eenheden en niet direct gerelateerd aan de werkelijke stroomwaarden. In deze zin, verder onderzoek is nodig om te valideren van deze correlatie. Laser doppler-flowmetrie wordt vaker gebruikt, maar beperkt door het feit dat het alleen perfusie meet in een enkel punt in de flap, terwijl LASCA de detectie van regionale veranderingen in huidperfusie in de flap15mogelijk maakt. Bovendien werd in een recente studie16 aangegeven dat Lasca de regio’s met een hoog risico op postoperatieve flap necrose kan vervoors pellen. Onze resultaten suggereren dat LASCA een veelbelovende techniek is voor de peri-en postoperatieve bewaking van vrije kleppen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoeksproject werd uitgevoerd in het minimaal invasieve chirurgie centrum van Jesús Usón (CCMIJU), onderdeel van de ICTS Nanbiosis. De studie werd uitgevoerd met hulp van de volgende Nanbiosis-eenheden: U21, experimentele operatiekamer; U22, huisvesting van dieren; en U14, celtherapie. Dit werk werd ondersteund door ISCIII project PI16/02164. De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit om te publiceren of manuscript voorbereiding. Speciale dank gaat uit naar María Pérez voor de voorbereiding van de cijfers en naar Fernanda Carrizosa voor voortdurende aanmoediging en ondersteuning van de wetenschappelijke bibliografie.
Materials
| AureFlo Unit | Transonic (Ithaca, USA) | N/A | Transit-time ultrasound flowmeter equipment |
| Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | RHR-SET. Art.No.00795 | Set of microsurgical instruments |
| FLOW-i | Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) | N/A | Anesthesia Delivery System |
| Micro clamps ABB-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00408V | Double microvascular clamp with frame |
| Micro clamps ABB-11 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00414V | Double microvascular clamp without frame |
| Micro clamps B-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00396V | Sigle microvascular clamp |
| Nylon suture 10/0 | Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) | 19921 | Microsurgical suture |
| OPMI Pentero 800 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | N/A | Surgical microscope |
| PeriCam PSI System | Perimed AB (Järfälla, Sweden) | N/A | Laser speckle contrast analysis equipment |
| Philips Intellivue MX450 | Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) | N/A | Monitoring system |
| Protector posoperatorio para roedores | Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) | P201400272 | Postoperative protector for rodents |
References
- Siemionow, M., Arslan, E. Ischemia/reperfusion injury: a review in relation to free tissue transfers. Microsurgery. 24 (6), 468-475 (2004).
- Wang, W. Z., Baynosa, R. C., Zamboni, W. A. Update on ischemia-reperfusion injury for the plastic surgeon: 2011. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (6), 685-692 (2011).
- Chen, K. T., et al. Timing of presentation of the first signs of vascular compromise dictates the salvage outcome of free flap transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 120 (1), 187-195 (2007).
- Sears, E. D., Chung, K. C. Replantation of finger avulsion injuries: a systematic review of survival and functional outcomes. The Journal of Hand Surgery. 36 (4), 686-694 (2011).
- Caterson, E. J., Lopez, J., Medina, M., Pomahac, B., Tullius, S. G. Ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation. The Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 51-56 (2013).
- Amin, K. R., Wong, J. K. F., Fildes, J. E. Strategies to Reduce Ischemia Reperfusion Injury in Vascularized Composite Allotransplantation of the Limb. The Journal of Hand Surgery. 42 (12), 1019-1024 (2017).
- Barre-Sinoussi, F., Montagutelli, X. Animal models are essential to biological research: issues and perspectives. Future Science OA. 1 (4), (2015).
- Shaughness, G., Blackburn, C., Ballestin, A., Akelina, Y., Ascherman, J. A. Predicting Thrombosis Formation in 1-mm-Diameter Arterial Anastomoses with Transit-Time Ultrasound Technology. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (6), 1400-1405 (2017).
- Ballestin, A., et al. Ischemia-reperfusion injury in a rat microvascular skin free flap model: A histological, genetic, and blood flow study. PloS One. 13 (12), 0209624 (2018).
- Kochi, T., et al. Characterization of the Arterial Anatomy of the Murine Hindlimb: Functional Role in the Design and Understanding of Ischemia Models. PloS One. 8 (12), (2013).
- Smit, J. M., Zeebregts, C. J., Acosta, R., Werker, P. M. Advancements in free flap monitoring in the last decade: a critical review. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 177-185 (2010).
- Krag, C., Holck, S. The value of the patency test in microvascular anastomosis: Correlation between observed patency and size of intraluminal thrombus: An experimental study in rats. British Journal of Plastic Surgery. 34, 64-66 (1981).
- Selber, J. C., et al. A prospective study of transit-time flow volume measurement for intraoperative evaluation and optimization of free flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 270-281 (2013).
- Briers, D., et al. Laser speckle contrast imaging: theoretical and practical limitations. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066018 (2013).
- Zotterman, J., Bergkvist, M., Iredahl, F., Tesselaar, E., Farnebo, S. Monitoring of partial and full venous outflow obstruction in a porcine flap model using laser speckle contrast imaging. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 69 (7), 936-943 (2016).
- Zotterman, J., Tesselaar, E., Farnebo, S. The use of laser speckle contrast imaging to predict flap necrosis: An experimental study in a porcine flap model. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 72 (5), 771-777 (2019).
