Visualizzazione del peptide batterico per la selezione di nuovi enzimi biotinylami

La biotinyalazione di una proteina crea un tag potente per il suo isolamento e rilevamento dell’affinità. La biotinylazione delle proteine ezimatiche è una modificazione post-traduzionale altamente specifica catalizzata dai ligas di biotina-proteina. La ligase biotina-proteina E. BirA è estremamente specifica e covalentmente biotinyla solo un numero limitato di proteine naturali a specifici residui di lisina¹. I vantaggi della biotinylazione catalizzata BirA sono attualmente sfruttati fondendo la proteina bersaglio con un piccolo peptide biotina aminoacido sintetico (AP) che è efficacemente biotinylated² e consente l’altamente specifico e biotinylazione in vivo e in vitro efficiente per co-espressione o aggiunta di BirA^3,4,5. Anche se la legatura biotina-proteina in vivo e in vitro BirA catalizzata è un’interessante strategia di etichettatura, la sua applicazione è limitata a campioni che contengono proteine Fuse AP. Lo scopo di questo metodo è lo sviluppo di nuovi mutanti di legamenti biotino-proteine che biotinylano selettivamente le proteine native non modificate e, quindi, espandono il numero di applicazioni in cui può essere utilizzata la strategia di biotinylazione enzimatica.

La funzione proteica può essere evoluta attraverso cicli iterativi della mutazione genica, della selezione e dell’amplificazione delle varianti genetiche con la funzione desiderata. Una strategia di selezione forte ed efficiente è fondamentale per l’evoluzione diretta e l’attività della ligase biotina-proteina è facilmente selezionata a causa del forte legame tra biotina e streptavidin ai suoi omologhi⁶. Le tecnologie di visualizzazione dei fagi consentono la selezione di fagi che visualizzano peptidi biotinylati^7,8. Poiché l’amplificazione di fagi isolati richiede l’infezione di un ospite batterico, tuttavia, la selezione dei fagi con streptavidina crea un collo di bottiglia in quanto il legame ad alta affinità della biotina alla streptavidina è praticamente irreversibile sotto non-denatura Condizioni. Per garantire il legame reversibile dei fagi biotinylati, sono stati utilizzati aftaepiine monomeriche con minore affinità che hanno portato a un modesto arricchimento di 10 volte⁷. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di visualizzazione batterica per l’isolamento delle nuove varianti BirA che elimina la necessità di eguagliare dalla matrice di affinità e quindi rimuove un collo di bottiglia dai precedenti sistemi di selezione BirA⁹. Infatti, il nostro sistema di visualizzazione batterico consente un >1,000.000 volte l’arricchimento di cloni attivi in un’unica fase di selezione^9,fornendo così un sistema di selezione efficace per l’evoluzione diretta di nuove varianti BirA.

Il nostro sistema di visualizzazione batterica è costituito da due componenti, BirA con un terminale C 6xIl suo tag e una proteina scaffold che consente la visualizzazione superficiale di un peptide bersaglio. Abbiamo usato la proteina scaffold potenziata circolaremente permutata proteina della membrana esterna X (eCPX) poiché l’efficace visualizzazione dei peptidi può essere osservata sia al bi-termini N che a quello C^10,11. La fusione della sequenza di peptidi di destinazione con il capo”C di eCPX assicura la biotinylaazione dei batteri che esprimono varianti BirA attive. I batteri consentono l’effettiva selezione di streptavidin come il peptide biotinylato ora visualizza sulla superficie (Figura 1a).

Lo scopo di questo metodo è quello di selezionare per nuove varianti di BirA che biotinylas sequenze di peptidi presenti nelle proteine native. Il sistema è codificato da geni presenti sul pBAD-BirA-eCPX-AP, che contiene un promotore arabo-inducibile che controlla BirA (araBAD), e un promotore T7 che controlla eCPX⁹ (Figura 1b). Il presente protocollo descrive la procedura dettagliata per 1) incorporazione di un peptide derivato da una proteina bersaglio nel terminale C di eCPX, 2) creazione di una libreria mutazionale di BirA mediante PCR soggetto a errori, 3) selezione di batteri leganti streptavidina lo smistamento cellulare attivato magnetica (MACS), 4) la quantificazione dell’arricchimento dei batteri e 5) la caratterizzazione iniziale dei cloni isolati.