Заражение мышей с Malassezia spp. для изучения взаимодействия гриба-хозяина
Summary
Этот протокол описывает создание мышиной модели для изучения взаимодействия Malassezia-хозяинав коже. Он описывает выращивание Malassezia in vitro, инфекции кожи морин с Malassezia, и последующий анализ воспаления и грибковой нагрузки в ткани кожи.
Abstract
Модели животных имеют решающее значение для исследований инфекционных заболеваний. Они обеспечивают важную основу для анализа всего спектра взаимодействий, которые происходят между микробами и их хозяина in vivo в ткани-специфическим образом. Патогенные грибы все чаще признаются в качестве серьезной угрозы для людей и эксплуатации таких моделей инфекции значительно улучшили наше понимание грибковой патогенности. Виды рода Malassezia являются наиболее распространенными грибами микробиоты кожи человека, и они также связаны с развитием тяжелых воспалительных кожных заболеваний, таких как себорейный дерматит и атопический дерматит. Тем не менее, причинно-следственная связь между Malassezia и патогенез болезни остается неизвестным, факт, который может быть связано с плохим знанием сложного перекрестного разговора Malassezia с иммунной системой кожи. Этот протокол описывает создание экспериментальной модели мыши, которая позволяет изучать взаимодействие Malassezia с кожей млекопитающих in vivo. В нем излагается метод выращивания Malassezia spp. в лабораторных условиях, как заразить кожу мурин с помощью Malassezia spp. и как оценить исход инфекции с помощью воспаления кожи и грибковых анализов бремени. Описанная здесь модель работает у полностью иммунокомпетентных животных и не полагается на иммунную супрессивную или антибиотиковую предварительную обработку животных. Кроме того, он адаптируется практически ко всем генетически модифицированным штаммам мыши и может быть объединен с другими моделями кожных заболеваний. Эти особенности делают эту модель инфекции очень мощным инструментом для детального изучения врожденного и адаптивного иммунного ответа хозяина против Malassezia в коже in vivo.
Introduction
Кожа населена множеством различных микробов. Постоянное воздействие кожи на микробиоту способствует формированию и обучению иммунной системы хозяина. Грибы все чаще признаются как жизненно важная часть микробиоты, и они выполняют важную роль для принимающей физиологии и иммунитета, похожие на бактерии и вирусы1. Виды рода Malassezia на сегодняшний день являются наиболее распространенными грибами колонизации кожи теплокровных позвоночных, и они составляют более 90% человеческой кожи микобиом2,3. Восемнадцать различных видов Malassezia до сих пор были определены из человека и животного кожи4.
Различные патологии кожи, как полагают, возникают, по крайней мере частично, в результате диссбалансированного состава микробиоты. Дисбактериоз может привести к разрастанию видов с патогенным потенциалом, что приводит к оппортунистическим инфекциям и болезни5. Последовательно, есть все больше доказательств того, что Malassezia, помимо его сословия образа жизни, способствует развитию различных патологий кожи, начиная от перхоти и pityriarsis versicolor к более тяжелым воспалительным расстройствам, такие как как себорейный дерматит и атопический дерматит4,6. Хотя причинно-следственная связь между Malassezia и pityriarsis versicolor была установлена, патофизиологическая роль гриба в более тяжелых патологий кожи остается в значительной степени неизвестно.
Определение роли Malassezia в гомеостазе кожи и болезни требует более углубленного знания о взаимодействии гриба с кожей и кожной иммунной системы. Следует отметить, что исследования по Malassezia, по сравнению с другими человеческими грибковых патогенов (например, Candida albicans или Aspergillus fumigatus), все еще в молодой стадии. Это можно объяснить трудностями в выращивании Malassezia в лабораторных условиях и отсутствием соответствующих экспериментальных моделей для изучения гриба в контакте с хозяином in vivo. Предыдущие эксперименты с изолированными клетками в культуре показали широкий спектр прямых и косвенных взаимодействий между Malassezia и различных иммунных и неиммунных клеток7. Тем не менее, эти эксперименты in vitro лишь частично резюмируют ситуацию сложной среды кожи in vivo, где одновременно происходят многочисленные клеточные и молекулярные события между грибком и различными типами клеток.
В этом случае мы наметили протокол для экспериментальной модели инфекции кожи Malassezia у мышей, которую мы недавно установили, для изучения взаимодействия гриба-хозяина in vivo7. Это включает в себя процедуры для (1) успешного выращивания Malassezia in vitro, (2) эпикутанеозное применение Malassezia на кожу уха, и (3) технические детали того, как анализировать Маласезияиндуцированной кожи воспаление и грибковое бремя инфицированной кожи. Важно отметить, что эта модель не опирается на иммуносупрессию (например, кортикостероиды) или лечение антибиотиками мышей до инфекции, как это практикуется в других моделях мыши грибковой инфекции8,9. В свою очередь, это позволяет изучать весь спектр врожденного и адаптивного иммунного ответа против Malassezia в нормальной коже. Следует отметить, что инбредные мыши дикого типа, соблюдаемые в специфических условиях без патогена (SPF), естественным образом не колонизированы с Малассезией и, следовательно, их воздействие гриба не приводит к постоянной колонизации, но очищается от хозяина внутри около 1,5 недель. Однако модель позволяет изучать механизмы инициирования и регуляции реакции противогрибкового хозяина, что, в свою очередь, является основой того, как генерируется иммунная память. Модель является универсальной в том, что она может быть легко применена к широкому спектру генетически модифицированных штаммов мыши и может быть объединена с другими существующими моделями кожных заболеваний, таких как модели барьерного дефицита, для изучения воздействия Malassezia под патологические и воспалительные заболевания кожи7. Таким образом, описанная модель экспериментальной инфекции кожи Malassezia у мышей обеспечивает высокую степень гибкости для исследования взаимодействия гриба с иммунной системой кожи в контексте гомеостаза и болезни.
Этот протокол описывает экспериментальную инфекцию кожи мышей с Malassezia spp. Из-за его патогенного потенциала, Malassezia spp. классифицируются как ПАтогенные микроорганизмы BSL2 в некоторых странах, включая Швейцарию. Пожалуйста, проверьте местные руководящие принципы и следуйте правилам местных властей. BSL2 классифицированных организмов должны обрабатываться квалифицированным персоналом в соответствии с BSL2 сертифицированных биобезопасности кабинета (BSC). Биологические отходы, загрязненные организмами, классифицированными BSL2, а также туши мышей, инфицированных такими организмами, должны быть аутоклавированы до их удаления. Для экспериментов с мышами необходимо приложить все усилия, чтобы свести к минимуму страдания и обеспечить высочайшие этические и гуманные стандарты в соответствии с принципами 3R (заменить, уточнить, уменьшить)10. Эксперименты, описанные в этом протоколе, были проведены с Помощью M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) и M. sympodialis (ATCC 42132)7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает инфекцию кожи широко используемого инбредного штамма мыши C57BL/6 Malassezia spp. Адаптация этого протокола к другим штаммам мыши с другим генетическим фоном (например, Balb/c) или генетически модифицированной мышью штаммы могут нуждаться в корректировке дозы инфекции, точечный момент (ы) анализа и т.д. Для обеспечения воспроизводимости, группы мышей всегда должны быть одного возраста и пола. Источник мышей должен быть стабильным, так как даже незначительные изменения в генетическом фоне и различия в микробиоте, которые существуют между поставщиками и могут существовать даже между различными единицами одного племенного предприятия, могут иметь непредсказуемое воздействие на инфекции. При настройке модели инфекции Malassezia, описанной в данном протоколе, рекомендуется провести экспериментальное исследование, чтобы тщательно контролировать ход инфекции, включая степень колонизации, кинетику грибкового зазора и степень воспаление и патология, которые могут быть индуцированы (например, если ухо кожи барьер-нарушендо до инфекции), чтобы определить оптимальные условия проверки.
Для обеспечения воспроизводимости и надежного выявления различий между экспериментальными группами количество животных, используемых в группе, должно быть рассчитано на основе статистического анализа. Размер выборки рассчитывается на основе размера эффекта, частоты ошибок и мощности, которые учитывают биологические и экспериментальные вариации (например, из-за изменения в иммунной системе). По этическим соображениям избегайте использования неоправданно большого количества животных. Что касается malassezia инфекции кожи, лечение только одно ухо с грибком и с помощью другого уха в качестве контроля в той же мыши, не рекомендуется, потому что мыши могут распространить грибок на оба уха при уходе. Тем не менее, использование 1 / 2 уха для различных методологических читать выходы, такие как определение грибковой нагрузки, изоляция иммунных клеток или гистологический анализ часто достаточно и приводит к значительному сокращению численности животных, используемых для экспериментов.
На сегодняшний день описано 18 различных видов малассезии. Меж- и внутривидовые вариации в роде Malassezia могут повлиять на взаимодействие с хозяином, как мы также узнали из исследований по другим человеческим патогенным грибам13. Различные виды и штаммы малассезии различаются по происхождению (например, M. pachydermatis является наиболее частым видом, изолированным от животных, в то время как M. restricta, M. globosa и M. sympodialis являются наиболее видных членов грибковой микробиом кожи у людей с переменным распределением этих видов между различными участками кожи). Некоторые виды были связаны с комменсализмом, в то время как другие считаются более патогенными, хотя подробные данные остаются относительно слабыми. Важно отметить, что некоторые виды и штаммы по своей сути труднее расти, чем другие. Таким образом, решение о том, какие виды/деформации использовать для инфекции, должно основываться на исследовательском вопросе.
Экспериментальная инфекция кожи мурин с некоторыми микробными организмами, такими как Candida albicans или золотистый стафилококк требуют нарушения эпидермального барьера до инфекции, например, с песчаной бумагой14, 15,16. В отличие от этого, модель инфекции Malassezia описано здесь одинаково эффективно с и без барьера нарушения7. Степень воспаления, вызванного грибком, значительно усиливается, если кожа лента раздели до инфекции7. Поэтому, следует ли манипулировать кожей до применения Malassezia зависит от вопроса исследования. Существуют различные модели хронического и острого воспаления кожи (например, модели для гиперчувствительности отложенного типа (DTH) и контактной гиперчувствительности (CHS)) и модели барьерного дефицита, которые могут представлять интерес для исследования вклада сопутствующих дрожжей к кожных патологиям.
Инбреты мышей поддерживается в соответствии с конкретными патогена свободных (SPF) условия (насколько нам известно) не естественно колонизированы с Malassezia. Таким образом, экспериментальное применение Malassezia на кожу мыши ухо представляет собой первичное воздействие грибка, который вызывает острую реакцию у хозяина, который, в свою очередь, приводит к грибкового зазора в течение 1 – 2 недель7. Хотя модель, описанная в этом протоколе, поэтому лишь частично отражает ситуацию в иммунокомпетентных людей или других организмов хозяина, которые постоянно колонизированы с Malassezia, экспериментальная инфекция позволяет достаточно окно возможность изучения противогрибкового иммунитета и клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе этой реакции. Он также позволяет исследовать различия в реакции на различные виды малассезии и штаммы в различных экспериментальных условиях (например, с и без барьера нарушения кожи).
Изучение Malassezia – взаимодействия хозяина были ограничены в прошлом, чтобы в пробирке эксперименты с изолированными типами клеток в культурах (например, кератиноцитов клеточных линий, PBMCs). Хотя эти исследования пролили некоторый свет на грибковые и принимающие детерминанты, которые формируют взаимодействие между Malassezia и принимающей17, они не позволяют получить полное понимание гриба – принимающей взаимодействия в комплексе окружающей среды кожи, которая включает в себя несколько типов клеток, которые находятся в постоянной связи, таких как кератиноциты, фибробласты и ткани-резидентиммунных иммунных клеток, но и лейкоцитов населения, которые проникают в ткани только при микробной встрече Кожи. Эта многоклеточная сеть не может быть полностью воспроизведена в моделях in vitro, даже с самыми передовыми органоидными системами. Таким образом, экспериментальная инфекция мышей по-прежнему представляет собой золотой стандарт в иммунологии и инфекционных заболеваний исследований, и наличие модели, описанной здесь представляет собой прорыв в области исследований Malassezia. Важно отметить, что эта модель опирается на эпикутанеозное применение Malassezia на иначе невозмутимой кожи мыши уха, и это не подразумевает прививку грибка путем инъекции в ткани, например, подкожно или интраперитоне, как Предыдущие исследования сообщили18, оба из которых более далеки от ситуации в естественно колонизированных хостов.
Возможность совместить модель инфекции Malassezia, описанную в этом протоколе, с другими доступными моделями мыши значительно увеличивает объем и гибкость применения. Последние включают в себя различные модели специфических кожных заболеваний, таких как модель барьерного дефицита, который имитирует важные особенности атопического дерматита, болезни, связанной с Malassezia у людей и собак. Кроме того, эпикутанетная инфекция кожи с Malassezia может быть легко применена к мышам с генетическими дефектами в генах-хозяинах, представляющих интерес, или мышей, в которых тип интереса клетки генетически удалены или могут быть фармакологически истощены (например, с помощью средств введения дифтерии токсина в дифтерии токсина рецепторов-выражающих мышей). Такие модели представляют собой неизбежный инструмент для вскрытия принимающей реакции на сопутствующие и патогенные микробы, в том числе Malassezia, и оценить роль этих генов и типа клеток в взаимодействии гриба-хозяина. Анализ взаимодействия кожи Малассезия-хозяинаможет быть расширен далеко за пределы того, что описано в этом протоколе. К ним относятся анализы гистологии (например, для определения степени патологии кожи или эпидермального утолщения, индуцированного грибком), иммуногистохимией или иммунофлуоресцентным окрашиванием секций тканей с использованием антител, направленных против клеточного типа конкретные маркеры или другие молекулы, представляющие интерес. Это также может включать в себя изоляцию клеток (например, ткани резидентов или ткани инфильтрации лейкоцитов подмножества) от инфицированных тканей кожи для изучения поляризации, регулирования и динамики иммунного ответа на Malassezia в большой глубине.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Цюрихским университетом, Швейцария.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | – | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | – | – | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | – | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
- Iliev, I. D., Leonardi, I. Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).
- Findley, K., et al. Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).
- Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).
- Theelen, B., et al. Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment. Medical Mycology. 56, 10-25 (2018).
- Williams, M. R., Gallo, R. L. The role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).
- . . Malassezia and the Skin. , (2010).
- Sparber, F., et al. The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocols. 7 (4), 637-642 (2012).
- Russel, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Wu, G., et al. Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin. PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).
- Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).
- Schonherr, F. A., et al. The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity. Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).
- Igyarto, B. Z., et al. Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses. Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).
- Liu, H., et al. Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses. Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).
- Nakagawa, S., et al. Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation. Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).
- Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin. Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).
- Yamasaki, S., et al. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).
