厳密嫌気性/無酸素条件下での微生物の培養のための培地製剤

1. 培地の調製 レドックス指標ストック溶液(レサズリン/100mL水溶液の0.1g)を調調します。 ビタミン溶液を調ます(表1)。 トレース要素ソリューションを準備します (表2)。注: 追加の順序は重要です。表 2および各プロトコルを参照してください。 還元剤ストック溶液(60gNa2S/L水溶液)を調記する。 中成分(ミネラル塩培地、表3)を適切なフラスコ(例えば、1Lスクリューキャップラボフラスコ)で計量する。注:実験の組み立てによっては、別の炭素源を追加する必要がある場合があります。 蒸留水(表3)の半分の量を追加し、材料を溶解します。 表 3に従って、1 mL のレドックスインジケーター ソリューションを追加します。 表 3に従ってビタミンおよび微量元素溶液を追加します。 表 3の中/生物の要件に従って pH を調整します。注:レドックス指標の色はpH依存であり、調整に時間がかかる場合があります。 蒸留水で1Lの最終容積に持って来なさい。注:ビタミンおよび微量元素溶液は、フィルター殺菌アリコート(希釈液、フィルター細孔サイズ<0.2 μm)を以前に閉じたオートクレーブ処理された血清フラスコに無菌的に添加することによっても追加できます。しかし、このアプローチは汚染のリスクが高い。 2. 栽培フラスコの充填 十分にきれいで、乾燥した120 mLの血清フラスコ。注:血清フラスコは異なった容積容量(例えば、20、60、120、250 mL)で利用できる。 徹底的にきれいなと乾燥ブチルゴムセプタ。 栽培フラスコ中の追加の培地成分(例えば、フェニル酸前駆体基質)を計量する。注: 追加のコンポーネントは、実験の設定と仮説によって異なります。 血清フラスコに50mLの培地を充填します。 3. 液体相における酸素の還元/除去 ~100°Cの水風呂を準備します。 水浴中に充填された血清フラスコをセットし、液相中のO2の溶解度を低減するために約20〜30分間インキュベートする。 N2ガスでヘッドスペースを直ちにフラッシュするか、N2/CO2のような他のガスまたはガス混合物でフラッシュします。注意:適切な部屋の換気の世話をします。 ブチルゴムセプタでフラスコを閉じ、アルミキャップで固定します。注:ゴムセプタは、多くの場合、それを掘削しながら、水/媒体の滴を追加することにより、フラスコの首にフィットする可能性があります。 還元剤(ストック溶液)を各フラスコに0.1mL添加し、50mLの培地で満たされた各フラスコに酸化還元電位(培地の50mL当たり還元剤の0.1mL)をさらに低減する。 121 °Cで20分のオートクレーブ。注意:閉鎖された容器の殺菌のために証明されるオートクレーブは使用されなければならない。そうしないと、温度上昇に起因する過圧によって血清フラスコが爆発する可能性があります。 4. 培地の接種 嫌気性消化器から接種を準備します。 400mLの蒸留水をフラスコに入れ、沸騰させます。 N2でヘッドスペースを恒久的にフラッシュしながら、それを冷却します (< 30 °C) 嫌気性消化器由来の汚泥を約100g加えます。注:酸素とスラッジの過度の接触を避けてください。 希釈の正確な決定のために追加されたスラッジの正確な質量を記録します。 フラスコのヘッドスペースをN2と交換し、ブチルゴム中隔で閉じます。 フラスコを120rpmで30分間振ります。 注射器+カニューレを使用して5mLの接種を取り除き、ステップ1-3に記載されているように調製血清フラスコに注入する。 5. インキュベーション、サンプリング、解析 接種された血清フラスコを、それぞれの実験に適した温度でインキュベートする。注:インキュベーション温度は、実験セットアップと使用される接種に依存します。 注射器+カニューレを用いて温度上昇に起因するドレイン過圧は、血清フラスコ中の液体がインキュベーション温度(インキュベーション温度に応じて約15~30分)に平衡化した場合に及ぶ。注意:適用された基板に応じて、その濃度、温度、インキュベーション時間、接種タイプおよび濃度、フラスコ内の過圧は>2棒圧力まで上昇し、血清の剥離が爆発する可能性があります。したがって、圧力計を使用して過圧を監視し、その後カニューレで過圧を排出することは必須です。 インキュベーション時間中にバイオガスの生産と組成を評価します。注:インキュベーション期間は数日から数週間に及ぶことができます。 現在の大気圧を記録します。 マノメーターを準備し、微生物活性に由来するフラスコ内の圧力を評価します。 フラスコを振ります。 注射器+カニューレを使用してヘッドスペースガスの1 mLを除去し、ガスクロマトグラフィーを介してH2、O2、CH4、および/またはCO2濃度を測定します。注:H2、O2、CH4、およびCO2の認定および定量のために、ガスクロマトグラフを使用して、160°C(カラムオーブン)、100°C(インジェクタ)、および180°C(熱伝導性検出器、TCD)の動作温度を適用しました。).N2はキャリアガスとして用いられた。詳細については、以前の研究10を参照してください。 揮発性脂肪酸(VFA)およびフェニル酸の濃度を監視します。VFAおよびフェニル酸分析では、移動相として5mM H2 SO4で実行されるUV検出器(220nm)を搭載したHPLCシステムを使用します。メソッドの詳細とサンプルストレージに関する追加情報については、以前の研究11を参照してください。注:VFAの分析は、他の多くの物理化学分析や顕微鏡評価の例示です。また、実験のある時点における微生物の特定の微生物および/または組成物の豊富さを標的とする分子生物学的方法は、記載された手順を用いて適用することができる。 注射器+カニューレで1mLの液体を取り除きます。注:サンプルは、撤退直後に凍結(-20°C)し、実験11の終了時に分析することができる。 15,000~20,000 x gの遠心分離機を使用し、0.2 μm RC(再生セルロース)フィルタを通過します。 HPLCシステムに5-20 μLを注入し、VFA組成物とフェニル酸の濃度を分析します。 カニューレを使ってフラスコの過圧を排水する。注:圧力とガス組成を決定し、必要なサンプルを採取した後、栽培フラスコをそれぞれの温度に戻し、液体がインキュベーション温度を達成する前に過圧を排出しないでください。 方程式1-3を使用して理想的なガス法則を考慮して、バイオガスおよびメタン産生VCH4Nを計算する。表4も参照してください。方程式 1:という方程式 2:そして方程式 3:注:バイオガスの総生産量の計算では、式2および3のCH4%およびCH4%Xの量を100に設定する必要があります。NmL:標準化された条件下での正規化ガス容積(0°C、1 atm)、その下でモルガス容積は22.414 NmL/mmolである。