Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV
Summary
O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.
Abstract
Mesmo na ausência de medicamentos antirretrovirais, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor do leite materno (BM). A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil apropriada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para as mães infectadas pelo HIV. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para reduzir a transmissão da BM. Lactentes amamentados ingerir ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora o que permanece em grande parte obscuro é a contribuição dessas células para as qualidades antivirais do BM. atualmente, objetivou-se isolar as células do BM humano para medir fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP), uma das respostas imunes inata as mais essenciais e as mais Pervasive, por fagócitos do BM de encontro aos alvos do HIV. As células foram isoladas de 5 amostras de BM humanas obtidas em vários estágios de lactação. A isolação foi realizada através da centrifugação delicada seguida pela remoção cuidadosa da gordura de leite e da lavagem repetida da pelota da pilha. Os grânulos fluorescentes revestidos com o epítopo do envelope do HIV (env) foram usados como alvos para a análise de ADCP. As pilhas foram manchadas com o marcador de superfície CD45 para identificar leucócito. Verificou-se que a atividade da ADCP foi significativa acima dos experimentos de controle e mensurável através de um anticorpo 830A específico para o HIV.
Introduction
O leite materno humano (BM) é constituído por células maternas que são > 90% viáveis1. A composição celular é fortemente impactada pelo estágio de lactação, estado de saúde da mãe e do lactente, e variação individual, que permanece pouco compreendida1,2,3,4. Dado que o BM contem ~ 103− 105 leucócito/ml, pode-se estimar que os infantes amamentados ingerem ~ 105− 108 leucócitos maternos diários5. Vários estudos in vivo demonstraram que os leucócitos maternos fornecem imunidade crítica ao lactente e são funcionais bem além desses sítios de ingestão inicial5,6,7,8 ,9,10,11. Todas as células derivadas da maternally ingeridas pelo lactente têm potencial para realizar funções imunes ao lado ou para compensar os leucócitos próprios do lactente12.
A transmissão materno-infantil (MTCT) do vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser uma crise em países com recursos limitados. Como as doenças diarreicas e respiratórias são responsáveis por taxas substanciais de mortalidade entre lactentes em países com recursos limitados, e essas doenças são significativamente reduzidas pelo aleitamento materno exclusivo, os benefícios para as mães infectadas pelo HIV a amamentação supera em muito os riscos13,14,15. A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil adequada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para mães infectadas pelo HIV16. Aproximadamente 100.000 MTCTs via BM ocorrem anualmente; no entanto, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por suas mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor da BM17,18,19,20,21. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para evitar a transmissão. Importante, os anticorpos HIV-específicos (ABS) no BM foram correlacionados com o MTCT reduzido e/ou a morte infantil reduzida da infecção de HIV22,23. O que permanece em grande parte obscuro é a contribuição da fração celular da BM para suas qualidades antivirais.
Muitos ABS facilitam uma variedade de atividades antivirais mediadas pela região ‘ constante ‘ da molécula de imunoglobulina, o fragmento cristalizável (FC), através da interação com receptores FC (FcRs) encontrados em praticamente todas as células imunes inatas, praticamente todos os quais são encontrados em humanos BM24. O fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP) foi demonstrado como necessário para o afastamento de infecções virais e foi subestudado no caso da prevenção do MTCT do HIV25,26,27, 28 anos de , 29. dada a escassez de conhecimento sobre a potencial contribuição da atividade da ADCP pelos FAGOÓCITOS da BM para a prevenção da MTCT do HIV, objetivou-se desenvolver um método rigoroso para isolar as células da BM humana, a fim de realizar um estudo de ADCP mediado por células de BM Obtido em vários estágios de lactação.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica baseada em citometria de fluxo para medir a atividade da ADCP descrita neste documento foi descrita pela primeira vez em 201130 e desde então tem sido comprovada robusta e citada em mais de 80 estudos. O protocolo descrito aqui adapta esta técnica para uso com células BM primárias pela primeira vez. Estudos prévios sobre a funcionalidade mediada pelo FC por células BM têm sido largamente limitados à mensuração de rajadas oxidativas ou ensaios de fagocitose baseados em histolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Susan Zolla-Pazner no departamento de medicina e departamento de Microbiologia da Icahn School of Medicine no Monte Sinai para revisão do manuscrito. O NIH/NICHD forneceu financiamento para este projeto o número de subvenção R21 HD095772-01A1. Além disso, R. Powell foi apoiado por fundos do departamento de medicina, divisão de doenças infecciosas, Icahn escola de medicina no Monte Sinai.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
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