Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.
Abstract
Burada, ex vivo transmigration sisteminde lenfosit kemokinetik hareketini değerlendirmek için temel laboratuvar becerileri ve malzemeleri ile yürütülebilecek etkili bir yöntem salıyoruz. Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2) ve CD4+ T yardımcı hücreleri tavuk yumurtası ovalbumin (OVA)-meydan BALB/ c farelerin dalak ve akciğerlerinden izole edildi. Hem CD4+ T hücrelerinde hem de ILC2’de CCR4 ekspresyonunu nispeten doğruladık. CCL17 ve CCL22 CCR4 için bilinen ligands vardır; bu nedenle, bu ex vivo transmigration yöntemini kullanarak CCL17– ve CCR4+ lenfositlerin CCL22 kaynaklı hareketi inceledik. Kemoin gradyanları oluşturmak için, CCL17 ve CCL22 transmigration sisteminin alt odasına yerleştirildi. İzole lenfositler daha sonra üst odalara eklendi ve 48 saat lik bir süre içinde lenfositler aktif olarak 3 μm gözeneklerden alt odadaki kemokine doğru göç ettiler. Bu lenfositlerin kemokinetikbelirlemek için etkili bir sistemdir, ama, anlaşılır, in vivo organ mikroortamlarında bulunan karmaşıklığı taklit etmez. Bu çalışma altında organ ve lenfositlerin yerinde görüntüleme eklenmesi ile aşılabilir yöntemin bir sınırlamadır. Buna karşılık, bu yöntemin avantajı, canlı görüntüleme çok daha uygun maliyetli bir oranda bir giriş seviyesi teknisyen tarafından yapılabilir olmasıdır. Terapötik bileşikler göçü artırmak için kullanılabilir hale geldikçe, tümör sitotoksik bağışıklık hücrelerine sızma durumunda olduğu gibi, ya da göçü inhibe etmek için, belki de immünolojinin endişe verici olduğu otoimmün hastalıklarda, bu yöntem tarama aracı. Genel olarak, ilgi chemokine sürekli medya kontrolü daha istatistiksel olarak daha yüksek bir düzeyde kemokinetik üreten ise yöntem etkilidir. Bu gibi durumlarda, belirli bir bileşik tarafından inhibisyon / geliştirme derecesi de belirlenebilir.
Introduction
Bu orijinal transmigration yöntemi Stephen Boyden tarafından 1962 yılında Journal of Experimental Medicine1’desunulmuştur. Kemotaksis ve keokinetik hakkında bildiklerimiz Boyden odasının gelişimi olmadan mümkün olmazdı. 1977 yılında ilk kemokin keşfinden önce, ex vivo transmigration sistemleri nötrofiller hücresel hareketlilik yükseltirken makrofajlarda hücresel hareketi durdurabilecek serum faktörleri hakkında bilgi edinmek için kullanılmıştır1,2. Bağışıklık hücresi göçü ile ilgili olarak büyük bir bilgi zenginliği geliştirilmiştir, ve bugüne kadar, 47 kemokinler şimdi 19 ilgili reseptörleri3ile keşfedilmiştir,4. Buna ek olarak, inhibitörleri / bu kemokin yollarının arttırıcılar çoksayıda terapötik amaçlar için geliştirme uğramıştır5,6,7,8. Bu bileşiklerin çoğu belirli bir kemokin 9 bileşikler ve bağışıklık hücresi yanıt arasındaki doğrudan etkileşimleri anlamak için benzer transmigration odalarında test edilmiştir.
Transmigration, veya diapedesis, iltihaplı doku içine açık enfeksiyon için sağlıklı bir inflamatuar yanıt için önemli bir süreçtir10,11. Bir Boyden odası, transmigration sistemi, veya transwell cihazları genellikle gözenekli bir membran1,12ile ayrılmış iki odacık oluşur. Alt oda en sık ilgi chemokine içeren medya tutar, lökositler üst odaya yerleştirilir iken. Membrandaki gözeneğin boyutu, ilgi çeken hücrenin büyüklüğüne göre seçilebilir. Bu proje için, lenfoid hücreler hücresel gelişim aşamasına bağlı olarak 7-20 μm boyutunda olduğundan, 3 μm gözenekli membran seçtik. Bu gözenek boyutu, bu hücrelerin gözeneklerin içinden pasif olarak düşmemesini, ancak kemokin degradesine yanıt olarak aktif olarak göç etmesini sağlar.
Bu protokolün en büyük avantajı maliyet etkinliğidir. In vivo transmigration zordur, çünkü hayvan taşıma ve cerrahi konusunda kapsamlı bir eğitim gerektirir ve genellikle bir araştırmacının her zaman kullanamadığı yüksek güçlü mikroskopi içerir. Transmigration’i artırıcı veya inhibe ettiği düşünülen bileşiklerin uygun maliyetli taranması in vivo görüntüleme öncesinde gerçekleştirilebilir. Transmigration sistemi sıkı bir şekilde kontrol edilince, hücreler başlangıçta transwell cihazına eklenebilir, ya da tam tersi, kemokin önce keokin inhibitörü ile tedavi edilebilir, sonra hücreler transwell cihazına eklenebilir. Son olarak, bu bariyer hücrelerinin kemokinetiklere katılımını anlamak için transwell insertinin altına transwell insert1-2 gün önce eklenebilir. Yine, sistemin bu manipülasyonlar vivo çalışmalarda daha karmaşık öncesinde belirli bir bileşiğin etkinliği hakkında önemli bilgileri belirleme güçlü bir araç sağlar.
Bir transmigration oda sistemi kullanarak çeşitli in vivo ve in vitro koşullar altında lenfosit hareketliliği değerlendirmek için etkili bir yoldur12,13,14. Burada, bir transmigration odasında kemokinlere ex vivo lenfosit duyarlılığını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yöntem tanımlıyoruz. Bu örnek deneyde, CD4+ T hücreleri ve grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2) OVA-alerjen maruziyetini takiben erkek ve dişi BALB/c farelerinden izole edildi. Alerjene meydan okuyan farelerden CCR4 + CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2’nin CCR4+ CD4+ T yardımcı hücrelerden ccl17 ve CCL22’ye daha verimli bir şekilde göç edeceği hipotezi oluşturuldu. CCL17 ve CCL22 genellikle dendritik hücreler ve M2 makrofajlar tarafından üretilen kemokinler (alerjik) fenotip, diğer hücreler arasında, alerji15,16. CCL17 ve CCL22 onlar kolayca hava yolu alevlenmeleri sırasında akciğerlerde tespit edilir gibi alerjik inflamasyon biyobelirteçleri olarak düşünülebilir16,17,18. Daha da önemlisi, CCR4 ekspresyonu, ev tozu işledi hayvanlardan izole edilen ILC2’den elde edilen biyoinformatik verilerde ortaya konan ve benzer şekilde IL-33 ile ex vivo ile tedavi edilen saf hayvanlardan ILC2’nin işlenmemiş kontrollere göre yükseltilir ( alerjen teşvik doğuştan sitokin) CCR419,20düzenler. Ayrıca, Immünolojik Genom Projesi veritabanında (www.immgen.org) ILC2 verilerine göre, CCR4 mRNA bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde yüksek oranda ifade edilir. Bugüne kadar ILC2’nin dokulara ticareti konusunda çok az şey bilinmektedir, ancak ILC2 ve CD4+ T hücrelerinin benzer transkripsiyon faktörleri ve reseptörleri ifade ettikleri için kemotaksiler ve kemokinetikler için benzer kemokinler ve reseptörler kullanmaları muhtemeldir. Böylece, CCL17 karşı CCL22 duyarlılık karşılaştırıldı, ILC2 ve CD4+ T lenfositler, hem erkek hem de kadın, OVA meydan hayvanlardan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, eksvivo transmigration sisteminde lenfositlerin kemokin kaynaklı göçlerini değerlendirmek için köklü bir yöntem sayılmiyoruz. Protokolde birkaç kritik adım vardır, bunlardan ilki deneydeki bağışıklık hücreleri üzerindeki doğru kemokin reseptörünün ekspresyonunu doğrulamaktır. Elimizde, biz alerjik inflamasyon Th2 yardımcı T hücrelerinde CCR4 önemini vurgulayan literatür vücut nedeniyle CCR4 seçti. Ovalbumin kaynaklı inflamasyon daha önce en az iki CCR4 antagonisti<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Amerikan Akciğer Birliği (K.J.W.), T.A.W. ve K.J.W.’ye verilen Memorial Eugene Kenney fonu, Utah Üniversitesi’nden K.J.W. için cömert başlangıç desteği ve T.A.W. (VA I01BX0003635) gaziler bölümü tarafından finanse edilmiştir. T.A.W. Gaziler İşleri Bölümü’nden Bir Araştırma Kariyer Bilim Adamı Ödülü (IK6 BX003781) sahibidir. Yazarlar Bayan Lisa Chudomelka editoryal yardım kabul etmek istiyorum. Yazarlar bu makale için oluşturulan akış sitometri veri toplama destekiçin UNMC Akış Sitometri çekirdek teşekkür ederiz.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 15250061 | |
| 1 mL syringe | BD Bioscience | 329424 | U-100 Syringes Micro-Fine 28G 1/2" 1cc |
| 100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Dilute to 1x in RPMI media |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | polypropylene tubes |
| 3 um transwell inserts | Genesee Scientific | 25-288 | 24-well plate containing 12 transwell inserts |
| 3x stabilizing fixative | BD Pharmigen | 338036 | Prepare 1x solution according to manufacturers protocol |
| 5 mL polystyrene tubes | STEM Cell Technologies | 38007 | |
| 50 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-106 | polypropylene tubes |
| 8-chamber easy separation magnet | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| Advanced cell strainer, 40 um | Genesee Scientific | 25-375 | nylon mesh, 40 micron strainers |
| Aluminum Hydroxide, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 239186-25G | 20 mg/mL |
| anti- mouse CCR4; APC-conjugated | Biolegend | 131211 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD16/32, Fc block | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse CD45; PE conjugated | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse ICOS (CD278) | BD Pharmigen | 564070 | 0.5 ug/test |
| anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated | BD Pharmigen | 553164 | 0.25 ug/test |
| anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated | Biolegend | 145311 | 0.5 ug/test |
| Automated Cell Counter | BIORAD | 1450102 | |
| Automated Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5% in serum-free RPMI |
| Cell Counter Clides | BIORAD | 1450015 | |
| Chicken Egg Ovalbumin, Grade V | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 ug/mL |
| Collagenase, Type 1, Filtered | Worthington Biochemical Corporation | CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) | 25 U/mL in RPMI |
| compensation beads | Affymetrix | 01-1111-41 | 1 drop per contol tube |
| Dissociation Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C |
| Heat Inactivated-FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media |
| mouse CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 ng/mL |
| mouse CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 ng/mL |
| mouse CD4+ T cell enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19852 | |
| mouse IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 ng/mL |
| mouse ILC2 enrichment kit | STEM Cell Technologies | 19842 | |
| mouse recombinant IL-33 | STEM Cell Technologies | 78044 | 20 ng/mL |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| Separation Buffer | STEM Cell Technologies | 20144 | 1 X PBS + 2% FBS; stored at 4C |
| small animal nebulizer and chamber | Data Sciences International | ||
| sterile saline | Baxter | 2F7124; NDC 0338-0048-04 | 0.9% Sodium Chloride |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
- Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
- Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
- Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
- Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
- Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn’s and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
- Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
- Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
- Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
- Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
- Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
- Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
- Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
- Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
- Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
- Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
- Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
- Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
- Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
- Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
- Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
- Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
- Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
- Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
- Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
- Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
- Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
- Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
- Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
