人卵成熟度评估及其临床应用

该协议描述了临床程序，这是标准IVF治疗的”附加”。它应由有经验的人员按照良好的实验室实践和临床指南24、25进行。建议获得合格患者的书面知情同意。该议定书得到机构道德委员会的批准。 1. 取卵和脱蛋 诱导卵巢刺激使用传统的刺激方案3。调整剂量到个人反应。当两个或两个以上卵泡，通过超声波扫描，达到直径18毫米，诱导卵母细胞成熟与应用250μg人类胆囊性促性腺激素（hCG）。在 hCG 注射后 35-36 小时安排卵母细胞拾取 （OPU）。 在 CO2独立处理介质（材料表）中收集检索到的积聚物-卵母细胞复合物 （COCs）。在CO2独立培养箱中短暂孵化期（10~15分钟）后，将收集的COC短暂（最多30秒）暴露于透明质尿酶溶液（材料表）。在立体显微镜下，通过用200μL滤波尖轻轻移液COCs，机械地去除积液-冠状细胞。 使用直径逐渐减小（200 μm、180 μm 和 150 μm）的脱脂微管器，从剩余的卵泡细胞中轻轻剥离卵母细胞，并在处理介质中清洗卵母细胞 3x。 根据细胞核和第一PB的存在或不存在，评估脱卵母细胞的数量和发育状况（图1）。 检查 PLM 考试的包含标准。如果 （1） 在 OPU 收集的小于 6 MII 卵母细胞对常规刺激有意外的不良反应，以及 （2） 以前受精失败或卵母细胞不成熟的历史，则执行卵子成熟度评估。 将GV、MI和MII卵母细胞放入IVF盘中的单独井中，每个井含有500μL的预平衡CO2依赖培养基（材料表），上面覆盖着矿物油（材料表）。 在5%O2和6%CO2的加湿气氛中，在37°C下再孵育3⁄4小时。 2. 为PLM考试和随后的ICSI做好准备 注：此处提供的协议描述了使用 OCTAX 极地 AIDE 系统 （材料表） 执行的 PLM 评估。或者，也可以使用其他市售的主轴视图系统。 准备胚胎培育板。 根据要检查的卵母细胞数量（MII 卵母细胞总数和 MI 卵母细胞在预孵育期间挤出 PB），准备 4 孔板或 12 孔板，分别用 500 μL 或 30 μL 培养基填充每个孔，并覆盖先前平衡的矿物油。 确保培养介质和矿物油在CO2培养箱中一夜之间得到平衡。将准备好的培养皿保存在CO2依赖培养箱中至少2小时。如有必要，请为井数，以跟踪单个卵母细胞的发育命运。 准备ICSI菜。 使用指定的塑料盘，为每个显示 PB 的卵母细胞制作 5 μL 预加热处理介质的滴，以及用于针清洗的额外滴。在ICSI（在ICSI之前添加精子）和预加热矿物油叠加之前，为精子固定制作一个额外的聚乙烯醇酮（PVP）溶液（PVP）溶液（材料表）。 将准备好的ICSI培养皿保存在CO2独立培养箱中至少20分钟。 如有必要，在ICSI之后，为井数以跟踪卵母细胞。 准备 PLM 检查盘。 使用分配的玻璃底盘，为每个显示 PB 的卵母细胞制作 5 μL 预加热处理介质液滴。覆盖预加热矿物油。 将培养皿保存在CO2独立培养箱中至少20分钟。必要时，在PLM检查后，为卵母细胞进行跟踪。 设置显微镜，以便进行 PLM 检查。 提前在倒置显微镜上切换加热台，以实现正确的加热温度。在微操作过程中，确保准确调整设置，使 PLM/ICSI 盘中的处理介质液滴保持 37 °C。 将无菌保持和 ICSI 针头放入显微注射支架，并加以聚焦。或者，使用孵化针。 选择适当的物镜（20x 和 25x 是最适合的），并确保冷凝器处于明亮的场位。 插入绿色干涉滤波器（指示灯变为绿色），并将液晶分析滑块设置为工作位置。 将快门设置为 ±50%，并调整圆形偏振器以降低背景噪音。 设置计算机准备进行 PLM 检查。 启动成像软件。 选择视频 |视频源 |极性在顶部菜单栏的视频菜单中。 切换到实时视频，转到视频页面，并通过点击视频工具栏中的图标（补充图1）来激活主轴和 zona 分析。 选择主轴成像期间动态缩放的显示模式：（1） 红色（双色）/绿色（背景）组合视图，或 （2） 白色（双色）/和黑色（背景）视图。动态评分模式用于自动评分的zona pellucida。 3. 鸡蛋成熟度检查 预孵育期（3⁄4 小时）后，在 ICSI 标准时间（hCG 触发后 39–40 小时）进行 PLM 检查，揭示卵母细胞成熟度状态。 将所有卵母细胞转移到 PLM 盘上的单个液滴中，并将其置于为主轴成像准备的倒置显微镜下。在开始检查之前，请记得从玻璃底盘上取下塑料盖。 将第一个卵母细胞聚焦。如果难以在绿灯下搜索单元格，则暂时拉出绿色滤镜。在分析之前，请确保插入绿色过滤器。 观察检测到的卵母细胞双色图像（绿色背景上的红色/橙色），因为它经过计算机处理，并在计算机屏幕上实时显示。请记住，信号在目镜中不可见。 如果宣布曝光过低/过高的消息弹出，请使用显微镜的光强旋钮将亮度调整到适当的强度。 使用保持针和 ICSI 指针转动卵母细胞，使 PB 处于 12 点钟位置，并将焦点聚焦到 PB。 如果在 PB 附近一见钟极，则通过稍微接触区域，轻轻转动每个轴周围的卵母细胞，以确保极化光与阵列主轴纤维对齐（补充视频）).宣布 MII 主轴不存在，只要卵母细胞未显示主轴信号，尽管旋转严格。 根据观察到的双核形态，将卵母细胞分为以下类别（图2）：（A）具有双极桶形MII主轴明亮信号的卵母细胞，其边界清晰划定，甚至分布于双核;（B） 具有变形、极性和半透明 MII 主轴的卵母细胞，具有不规则的边界和信号分布不均匀;（C） 卵母细胞，在卵母体中无可检测的MII主轴双重质;  （D） aa相 I/端相 I 卵母细胞，显示微管桥（第一 PB 和卵母细胞之间的连接链），而不是 MII 主轴。注： 具有可检测 MII 主轴信号（A 级或 B 级）的卵母细胞适用于即时 ICSI。 拍摄快照 （F9） 或录制视频以进行报告和/或后续图像分析。保留图像模式的文档，以减少操作员的主观性。 移动到下一个卵母细胞的位置，并重复步骤 3.6_3.9。 4. 优化ICSI计时 将所有主轴阳性卵母细胞（A级或B级，步骤3.8）转移到ICSI盘中，并根据标准协议24、25进行ICSI处理。 如果卵母细胞显示没有可检测到的MII主轴信号，将PLM盘放入CO2- 独立的培养箱中，并将ICSI移入以后的时间。 执行 PLM 重新检查 +2⁄3 小时后执行步骤 3.3_3.9。如果某些卵母细胞仍然缺乏 MII 主轴，则进一步延迟 ICSI 1⁄2 小时。 将所有卵母细胞转移到ICSI盘中，并根据标准协议24注射。如果 PLM 盘与显微注射针的弯曲角度兼容，则在切换到明亮场模式后立即在 PLM 盘中执行 ICSI。 在ICSI，将卵母细胞移植到准备板用于胚胎培育和培养，直到胚泡阶段。