تقييم نضج البويضة البشرية وتطبيقها السريري
Summary
نحن نقدم الخطوط العريضة للبروتوكول السريري للتقييم غير الغازية لنضج البويضة البشرية باستخدام الفحص المجهري الخفيف المستقطب.
Abstract
التوقيت الأمثل لحقن الحيوانات المنوية intracytoplasmic (ICSI) هو مصدر قلق خطير لبرامج الخصوبة لأن دخول الحيوانات المنوية في الوقت المناسب يقلل من الكفاءة التنموية للبويضة. وجود أول جسم قطبي (PB) جنبا إلى جنب مع المغزل meiotic يشير إلى الانتهاء من نضج البويضة واستعداد البويضة للإخصاب. في الممارسة السريرية، فمن المعتاد أن نفترض أن جميع البويضات التي تعرض PB هي البويضات metaphase ناضجة (MII). ومع ذلك، البثق PB يسبق تشكيل المغزل MII ثنائي القطب. هذا التزامن يجعل مجرد وجود PB علامة غير موثوق بها من نضج البويضة. يسمح التصوير المغزل غير الغازية باستخدام الفحص المجهري الضوئي المستقطب (PLM) بالفحص السريع والسهل لمعرفة ما إذا كانت البويضة التي تعرض PB قد أعادت تجميع المغزل الميوتيك قبل الحقن المجهري. هنا، نقدم بروتوكول قياسي لإجراء تقييم نضج البويضة البشرية في المختبر السريري. كما نعرض كيفية تحسين وقت الحقن المجهري فيما يتعلق بمرحلة نمو البويضة من أجل منع حقن الحيوانات المنوية المبكرة للبويضات المتأخرة النضج. باستخدام هذا النهج، حتى البويضات غير ناضجة البثق PB في المختبر يمكن استخدامها سريريا. تأكيد أن المغزل MII موجود قبل حقن الحيوانات المنوية والتكيف الفردي من وقت الحقن المجهري مهم بشكل خاص في سوء التكهن دورات الإخصاب في المختبر (IVF) مع عدد قليل من البويضات المتاحة للإخصاب.
Introduction
لتصبح بويضة الهابلويد القابلة للإخصاب، يجب على البويضة ثنائية الديلويد أن تضخ نصف معلوماتها الوراثية في خلية مجاورة، تسمى أول جسم قطبي (PB)، ومحاذاة الكروموسومات في خط الاستواء من مغزل المرحلة الفوقية الثانية ثنائي القطب (MII). في حين يمكن ملاحظة PB بوضوح عن طريق الفحص المجهري الخفيف التقليدي، فإن الكشف عن المواد الوراثية والهياكل الهيكلية الخلوية يتطلب عادة إجراءات تحضيرية الغازية التي تتعارض مع استخدام البويضة بشكل أكبر لعلاج الخصوبة. وبالتالي، في الممارسة السريرية، ويعتبر وجود PB كسمة مميزة لنضج البويضة. ومع ذلك، كشف التصوير الحي لديناميات الأنابيب الدقيقة والكروموسوم أثناء نضج البويضات البشرية أن PB يصبح مرئيا بضع ساعات قبل أن يتم تجميع المغزل MII ثنائي القطب ويتم محاذاة الكروموسومات1. ومع ذلك، في الضوء المنقولة، وMII القبض على البيض لا يمكن تمييزها عن البويضات التي دخلت للتو عملية فصل الكروموسوم. وهكذا، قد تحتوي مجموعة من البويضات، المصنفة على أنها بويوسية MII على أساس وجود PB فقط، على البويضات التي لم تستكمل بعد تطورها وبالتالي ليست جاهزة للإخصاب.
تأخير نضج البويضات من المرجح أن يؤثر على السكان من المستجيبين الفقراء مع عدد منخفض من البويضات MII ونسبة عالية من البويضات غير ناضجة التي تم جمعها بشكل غير متوقع في دورات حفز2. في الجسم الحي، واحد فقط، بيضة ذات جودة أفضل يحقق النضج ويصبح مبيض. في دورات الإخصاب في المختبر (IVF)، يتم استخدام فرط تحفيز المبيض الخاضع للرقابة لتجنيد البويضات المتعددة للنضج. الطفرة Gonadotropin يؤدي إلى استئناف برنامج meiotic وذرية البيض من المفترض أن تصل إلى مرحلة الاعتقال MII في غضون 36 ساعة3. ومع ذلك، فإن البويضات التي يتم استردادها من بصيلات ما قبل الأوبلاتورية غالباً ما تشكل مجموعة متنوعة من بويضات MII المعروضة والبويضات غير الناضجة، إما في المرحلة الفوقية الأولى (MI) أو مرحلة الحويصلة الجرثومية (GV) (الشكل 1). تخضع البويضات MII فقط لحقن الحيوانات المنوية intracytoplasmic (ICSI) في حين يتم التخلص من البويضات غير الناضجة عادة. ومع ذلك، عندما تزرع في المختبر، ويلاحظ عادة الكريات البيض MI لقذف PB في المختبر. على الرغم من دونيتها العامة، وقد تم استخدام البويضات في وقت متأخر النضج التي أكملت تلقائيا أول انقسام meiotic خلال ثقافة بين عشية وضحاها بنجاح كالبويضات المورد الأخير، وتم الإبلاغ عن المواليد الأحياء4،5 ،6،7،8. وبالتالي ، فإن الحقن المفاجئ للنطفية قد يكون السبب الرئيسي الكامن وراء النتائج التنموية السيئة للبويضات المتأخرة التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات السابقة9،10،11.
يسمح الفحص المجهري الضوئي المستقطب (PLM) مع برنامج معالجة الصور بالتصور غير الغازي للمغزل الميوتيك في البويضة الحية. يتم إنشاء انعكاس مزدوج من خلال التفاعل من شعاع الضوء الاستقطاب مع الجمعية أمر للغاية من microtubules بناء المغزل ثنائي القطب. وبما أن الضوء المستقطب هو من الكثافة العادية، يمكن استخدام هذه التقنية بأمان في البيئات السريرية لعرض ديناميات جهاز التقسيم11،12،13،14. وقد تم تحديد وجود birefringence المغزل MII داخل البويضة كعلامة على الكفاءة التنموية للبيضة9،15،16،17،18، 19،20،21،22،23. وهكذا، فقد اقترح أن التصوير المغزل meiotic غير الغازية يمكن استخدامها لمراقبة جودة البيض في الممارسة السريرية11،14،20.
منذ تمحلالجدول الزمني لديناميات الأنابيب الدقيقة أثناء داء المكورات الأنبوبية 1 ، يمكن أن يكون نمط الحركة الشعبية لتحرير السودان الملاحظ أفضل صلة بمسار الوقت من MI إلى MII الانتقال. بعد وقت قصير من انبعاث PB، يصبح المغزل MII الوليدة غير قابل للكشف من قبل PLM. ومع ذلك، إذا تم الاحتفاظ البويضات في الثقافة، قد تظهر إشارة birefringence في وقت لاحق عندما يعيد المغزل MII ثنائي القطب تجميع9،10،11. وهكذا، في البويضات البثق PB في المختبر، قد يكون غياب المغزل مؤقتة فقط المقابلة للانتقال الفسيولوجي للبويضة في وقت متأخر النضج من MI إلى مرحلة MII. إذا كانت إشارة المغزل MII غير قابلة للكشف، يمكن تأجيل حقن الحيوانات المنوية إلى نقطة زمنية لاحقة توفير وقت إضافي لتشكيل المغزل MII. الاستفادة المثلى بمساعدة PLM من وقت الحقن المجهري يزيد من فرصة استخدام البويضات المتأخرةالنضج سريرياً وإحداث فرق للمرضى الفقراء في التكهن 9.
أدناه، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لكيفية إجراء التصوير المغزل غير الغازية في البويضات البشرية. كما نبين كيف يمكن استخدام الحركة الشعبية لتحرير السودان لتجنب خطر الإخصاب المبكر للبويضات المتأخرة النضج.
Protocol
Representative Results
Discussion
المغزل الميوسيتي اللاسنتروسومي في البويضات البشرية ديناميكية للغاية وبنية حساسة1. في ظل الظروف دون المستوى الأمثل، وألياف microtubule depolymerize بسرعة والمغزل meiotic تفكيك30،31،32،33. وبالتالي، من المهم للغاية ضمان أن تكون ثقافة البويضة وظروف المعالجة الدقيقة، وهي درجة الحرارة ودرجة الحموضة في النطاق الأمثل. لتقليل خطر اضطراب المغزل، يجب أن تبقى البويضات في بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة تحافظ على 37 ± 0.5 درجة مئوية في وسائل الإعلام البويضة. مطلوب بدقة استخدام المجاهر وإعداد الحقن المجهري مجهزة مرحلة ساخنة. يجب أن يتم كل التلاعب مع البويضات خارج الحاضنة في HEPES / MOPS وسائل الإعلام المخزنة لتجنب التذبذبات الحموضة. لتجنب الآثار السلبية المحتملة لتسليم البويضة المفرطة في حالة المحيطة، يجب ألا يتجاوز الوقت الإجمالي لفحص الحركة الشعبية لتحرير السودان 10 دقائق. يجب تحليل البويضات على الطبق السفلي الزجاجي مع إزالة الغطاء البلاستيكي لأن تحديد مواقع البلاستيك القياسي في مسار الحزمة يضعف تحليل الصورة. لأن الأطباق البلاستيكية والزجاج القاع لها خصائص حرارية مختلفة، وينبغي فحص درجة الحرارة مباشرة في قطرات من التعامل مع المتوسطة في طبق الفحص.
وبالإضافة إلى الظروف المختبرية، يمكن أن يكون للاختلافات الإجرائية ومهارات التلاعب الجزئي لدى المشغل تأثير على دقة فحص الحركة الشعبية لتحرير السودان. فقط المغزل ثنائي القطب تجميعها للغاية يمكن تصورها بشكل غير غازي. الإشارة الملاحظة تتناسب مع درجة التنظيم الهيكلي للمغزل. المغزل الوليدة، القطبية، خففت أو مشوشة لا تظهر سوى عدم وضوح birefringence أو لا شيء على الإطلاق (الشكل3 والشكل 4). إلى جانب ذلك، محاذاة ناقصة من الضوء المستقطب مع صفائف microtubule تنتج فقط birefringence شفافةوغير محددة على الرغم من الوجود الفعلي للمغزل ثنائي القطب متطورة (الشكل 4). ما لم تكن موجهة بشكل صحيح، قد يكون من السهل أن تفوت إشارة المغزل والنضج البويضة تشخيصها بشكل خاطئ (فيديوتكميلي). للتصوير الأمثل المغزل، يجب أن تتحول البويضة بشكل صحيح حول كل محور. وبما أن الـ birefringence غير مرئي في الأعين، فإن المشغل يجب أن يشاهد شاشة الكمبيوتر أثناء إجراء دوران البويضة. الخبرة السابقة مع التلاعب الدقيق وتدريب التصوير المغزل في فائض في المختبر نضجت البويضات هو مرغوب فيه قبل التحول إلى التطبيق السريري.
وإلى جانب المغزل، فإن الخلايا الركام المحيطة بالبويضة، والوليما، والطبقة الداخلية من الزونا بيلوسيدا وبعض الهياكل السيتوبلازمية (على سبيلالمثال، الهيئات الحرارية، الفراغات) تظهر ثنائية الهوامش (الشكل 5A-D). ما لم تتم إزالتها بدقة من البويضة قبل التصوير، تنتج الخلايا الجريبية المرفقة بإحكام ضوضاء في الخلفية وحلول وسطية للكشف عن المغزل المتحيّف. يجب الحرص على عدم خطأ جسم حراري كبير للمغزل. العديد من التضمينات السيتوبلازمية المقيمة في السيتوبلازم عرض سطوع عالية التي تتناقض بشكل حاد مع الخلفية المظلمة. ومن ناحية أخرى، لا يظهر المغزل الميوتيك سوى إشارة معتدلة، وحدود غير واضحة، وعادة ما يعلق على الأوليما تحت أو بجوار أول PB. في بعض الأحيان، يكشف فحص PLM انحراف المغزل الإجمالي عن وضعها القياسي (الشكل5E،F). إذا كان هناك اختلال كبير بين جهاز التقسيم وPB، تساعد PLM على توجيه البويضة لتجنب خطر الإصابة بالمغزل أثناء الحقن المجهري. لا يبدو أن الوضع النسبي للمغزل داخل البويضة يؤثر على الإمكانات التنموية للأجنة الناتجة17،34. ومع ذلك، عندما ينفصل المغزل بشكل تنافسي عن الأوليما، تحدث تشوهات الإخصاب. ومن المثير للاهتمام، بعض البويضات ذات الجودة السيئة تخضع لإزالة التكثيف الكروماتين مباشرة بعد قذف PB بدلا من بدء النوى microtubule (الشكل4F). باستخدام الفحص المجهري الضوئي التقليدي وPB كعلامة فقط على نضج البويضات، تعتبر هذه البويضات الفرعية المختصة قابلة للتخصيب. وهكذا، بالإضافة إلى التقييم المورفولوجي الروتيني، يضيف التصوير المغزل معلومات هامة حول نضج البويضة ويمكن أن يكون بمثابة علامة غير مباشرة لجودتها.
ومن المرجح أن يتأثر حدوث البويضات المدورة من MII بخصائص السكان الذين شملتهم الدراسة (مثل الخلفية الوراثية، والحالة الطبية، وعمر الأم). وبالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة البويضات المتأخرة من الناحية الإنمائية داخل المجموعة سوف تؤثر على العدد الفعلي للالبويضات المغزل السلبية المكتشفة9،27. التصور المغزل Meiotic يجعل من الممكن لتحديد واضح البويضات القابلة للإخصاب التي تم القبض عليها في مرحلة MII. وعلاوة على ذلك، فإن الفحص الثاني في وقت لاحق قد يكشف ما إذا كانت البويضة السلبية المغزل غير طبيعية أو أنها لم تتقدم إلا مؤخرا من خلال انتقال MI /MII9و10و11. عندما يسمح لتطوير المغزل قبل الحقن المجهري، حتى البويضات غير الناضجة، والتي يتم تجاهلها بشكل روتيني، يمكن أن تنتج الأجنة قابلة للحياة9. في دورات مع عدد قليل جدا من البويضات المتاحة للإخصاب، يمكن أن يكون الحقن المجهري في الوقت المناسب بدقة من البويضات البثق PB بمثابة استراتيجية الإنقاذ وبديل لإلغاء دورة.
ومع ذلك ، لا ينبغي تعميم تمديد وقت ما قبل الحضانة لجميع البويضات. في الجسم الحي نضجت البويضات من المستجيبين العاديين عادة ما تظهر المغزل MII9،20،21،27. هنا ، تنخفض فرصة التصوير المغزلي الناجح مع مرور الوقت نتيجة لمرحلة ما بعد الإباضة في المختبر الشيخوخة35. إذا كان ذلك ممكنا، يجب أن يتم الحقن المجهري في يوم الاسترجاع ويجب أن لا تتجاوز 9 ساعات (45 ساعة بعد hCG)، وهي الفترة المرتبطة بانخفاض في نوعية الجنين الناتجة36،37. يجب أن تخضع البويضات التي تعرض المغزل ثنائي القطب المتميز ة لـ ICSI دون مزيد من التأخير. وباختصار، فإن التحسين الفردي لتوقيت الحقن المجهري أمر جدير بالاهتمام في المرضى الذين يعانون من سوء التكهن لاستبعاد أي خطر لحقن الحيوانات المنوية قبل الأوان. ومع ذلك، فإنه من غير الضروري، وتستغرق وقتا طويلا جدا وشاقة ليتم تنفيذها في جميع دورات التلقيح الاصطناعي.
يكشف تحليل الحركة الشعبية لتحرير السودان ما إذا كانت البويضة قد وصلت إلى مرحلة MII. ومع ذلك، فإن التصور غير الغازية للمغزل الميوتيك لا يوفر أي معلومات حول تنظيم الكروموسوم. قد يكون هناك خلل شديد في الكروموسومات و/أو تقسيم الكروماتيد المرتبط بالعمرالأمومي في البويضات التي تتميز بمغزل ثنائي القطب (الشكل 5). عوامل أخرى مختلفة لها تأثير كبير على نجاح الإنجاب (على سبيل المثال، عامل الحيوانات المنوية، الميتوكوندريا، تنشيط الجينوم الجنيني، الانقسام غير المنتظم، علم الوراثة، بطانة الرحم، مناعة الأمومة). لذلك، الكشف عن المغزل MII في حد ذاته، لا يضمن نتيجة سريرية إيجابية من إجراء التلقيح الاصطناعي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مختبر علم الأجنة في إعادة الربح الدولية. كما نعترف بالمرفق الأساسي لـ CELLIM من CEITEC بدعم من MEYS CR (LM2015062 Czech-Bioimaging) لدعمها في الحصول على بيانات التصوير المناعي ة المعروضة هنا.
Materials
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. . Ovarian Stimulation Protocols. , (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI?. Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates?. Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Montag, M., Morbeck, D. . Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. , (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes?. Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
