多重共免疫沈殿を用いたタンパク質相互作用ネットワークダイナミクスの定量化
Summary
定量多重免疫沈殿(QMI)は、2つのサンプル間の標的タンパク質相互作用の豊富さの違いを敏感に検出するためにフローサイトメトリーを使用します。QMIは、少量の生体材料を用いて行うことができ、遺伝子組み換えタグを必要とせず、以前に定義されたタンパク質相互作用ネットワークに適応させることができる。
Abstract
動的タンパク質とタンパク質の相互作用は、運動性からDNA複製、シグナル伝達まで、細胞の挙動を制御します。しかし、タンパク質相互作用ネットワーク内の複数のタンパク質間の動的相互作用のモニタリングは技術的に困難です。ここでは、暴露によって検出された共有複合体におけるタンパク質の相対的な蛍光測定に基づくタンパク質相互作用の倍の変化を定量的に評価できる定量多重免疫沈殿(QMI)のプロトコルを提示する。サーフェスエピトープ(PiSCES)。QMIでは、細胞リザートからのタンパク質複合体を微小球に免疫沈殿させ、PiSCESの豊富さを定量化するために異なるタンパク質の標識抗体を用いてプローブする。免疫沈殿抗体は、異なるMagBeadスペクトル領域に結合され、フローサイトメーターが複数の並列免疫沈殿を区別し、同時に各に関連するプローブ抗体の量を定量化することができます。QMIは遺伝的タグ付けを必要とせず、他の免疫沈殿法と比較して最小限の生体材料を使用して行うことができます。QMIは、相互作用するタンパク質の任意の定義されたグループに適応することができ、これまでT細胞および神経グルタミン酸シナプスのシグナル伝達ネットワークを特徴付けるために使用されてきた。結果は、潜在的な診断および治療用途を有する新しい仮説生成につながった。このプロトコルには、初期抗体パネルの選択からアッセイの実行およびデータの分析に至るQMIを実行する命令が含まれる。QMIアッセイの初期アセンブリは、パネルを生成する抗体をスクリーニングし、適切なリシスバッファーを経験的に決定することを含む。その後の試薬調製物には、MagBeadsに対する免疫沈殿抗体を共生的に結合し、ストレプトアビジン結合蛍化フルオロフォールによって標識できるようにビオチン化プローブ抗体が含まれる。アッセイを実行するために、ライセートを一晩MagBeadsと混合し、次いでビーズを異なるプローブ抗体で分割してインキュベートし、次いで蛍色素標識を、フローサイトメトリーで読み取ります。実験条件によって大きく異なる PiSCES を識別するために 2 つの統計検定が実行され、結果はヒートマップまたはノードエッジダイアグラムを使用して視覚化されます。
Introduction
動的タンパク質とタンパク質の相互作用は、ほとんどの細胞生理学の機能的基礎である分子シグナル伝達カスケードおよびモチル構造を構成する1.これらのプロセスは、単一の入力に基づいて定常状態を切り替える線形シグナル伝達経路として描かれることが多いが、実験データとモデリングデータは、それらが統合ネットワーク2、3として機能することを明確に示している。4.Gタンパク質の場合、異なる受容体は同じGタンパク質を活性化する能力を有することが多く、単一の受容体は複数のタイプのGタンパク質5、6を活性化することもできる。比較的少数のGタンパク質クラスがシナプス伝達、ホルモン調節、細胞移動などの膨大な配列の細胞機能を特異的に調節するためには、細胞はこれらのシグナルを統合し、分化する必要があります4,5.このシグナル特異性は、Gタンパク質および他のタンパク質に対して、主に微調整されたタンパク質-タンパク質相互作用およびその時間的ダイナミクス1、3に基づいて導出される、4,5,6,7.シグナリングネットワークは、複数の入力、出力、およびフィードバックループを持つ動的タンパク質複合体で構成されているため、単一の摂動は細胞の生理学の全体的な恒所的バランスを変更する機会を有する4 、7.複数の入力の統合が健康と病気7、8の離散細胞機能を制御する方法をよりよく理解するために、シグナル伝達をネットワークの観点から検討する必要があることは今広く合意されています。 9,10,11,12,13.これを踏まえ、動的タンパク質相互作用ネットワークにおける倍の変化に関する中程度のスループット、定量的データを収集するために、定量多重免疫沈殿(QMI)を開発しました。
QMIは、細胞リサートを蛍光色素の異なる比率を含む磁気ビーズに共存結合した免疫沈殿抗体のパネルでインキュベートする抗体ベースのアッセイです。特異的な抗体を明確な磁気ビーズクラスに結合すると、同じリサートからの複数の標的タンパク質の同時共免疫沈殿が可能になります。免疫沈殿(IP)に続いて、磁気ビーズは、第2の、フルオロフォア共役プローブ抗体(またはフッ素蛍結合ストレプトアビジンと共にビオチン化抗体)でインキュベートされる。各IP抗体プローブ抗体対によって認識されるタンパク質、またはPiSCES(暴露表面エピトープによって検出された共有複合体中のタンパク質)との共結合は、フローサイトメトリーによって検出され、異なる異なる間で定量的に比較することができるサンプル条件14.図1の図は、蛍光共役プローブ抗体によって標識された免疫沈殿タンパク質複合体を有する磁気ビーズの図を含むQMIアッセイの実行に関与するステップを示す(図1C)。
QMIの感度は、免疫沈殿に使用される磁気ビーズの数に対するリサートのタンパク質濃度に依存し、10%の折りたたみ変化を検出する分解能を達成するには、他の物質に比べて少量の出発物質しか必要とされない共同 IP メソッド14,15.例えば、QMIで使用される開始物質の量は、サンドイッチ酵素結合免疫ソルベントアッセイ(ELISA)に必要とされるものと同様であるが、単一のQMIアッセイで複数の相互作用が検出される。20のIPおよび20のプローブターゲットを用いてQMIアッセイは、マウス前頭前皮質の3mm冠動脈セクションから単離された1-5 x 105の一次T細胞、および3 x 106培養マウス原発を用いて行われた。皮質ニューロン14,16,17.この感度により、QMIは、臨床サンプルなどの限られた可用性を持つ細胞または組織の分析に有用です。
QMIは、以前に定義されたタンパク質相互作用ネットワーク(抗体が利用可能な場合)に適応することができ、現在までに、T細胞抗原受容体(TCR)シグナルポソームおよびニューロン中のグルタマチングシナプスにおけるタンパク質のサブセットを分析するために開発された。17歳,18.T細胞受容体シグナル伝達の研究において、QMIは、PiSCESにおける刺激誘発性変化を同定し、次いで対照群から自己免疫患者を区別し、内因性自己免疫シグナル伝達を検出し、最後に相互作用の不均衡な疾患関連サブネットワークを含む仮説14.より最近では、同じQMIパネルを使用して、TCR関連タンパク質シグナル伝達19における定性的差ではなく定量的な選択によって決定されるのが同じである。ニューロンにおいて、QMIは、シナプス可塑性17の新しいモデルを支持する方法で、異なるタイプの入力シグナルに対するタンパク質相互作用ネットワークの入力特異的再配置を記述するために使用された。さらに、このシナプスQMIパネルは、自閉症の7つのマウスモデルの違いを特定し、PiSCESのバイオシグネチャに基づいてモデルをサブグループにクラスター化し、以前は認識されていなかった共有分子欠損を正確に仮定するために使用されました。モデル16の1つで.同様のアプローチを使用して、異なる薬物治療に応答する可能性のある他のサブグループをスクリーニングしたり、特定の応答性のサブグループに薬物を割り当てたりすることができます。QMIは、基礎科学に加えて、診断、患者サブタイピング、および薬剤開発に潜在的なアプリケーションを持っています。
QMI抗体パネルを組み立てるには、初期抗体スクリーニングおよび選択プロトコルを以下のセクション1に記載する。抗体パネルが同定されると、選択された抗体をIP用の磁気ビーズに結合するためのプロトコル、および選択されたプローブ抗体の生体化のためのプロトコルがセクション2に記載されています。細胞または組織のライサテス上でQMIアッセイを実行するためのプロトコルは、セクション3に記載されています。最後に、単一の実験で~5 x 105個の個別データポイントを生成できるため、データ処理、分析、および視覚化を支援する命令とコンピュータコードがセクション4で提供されます。セクション 2-4 で説明するワークフローの概要を図 1に示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
QMIアッセイは、抗体パネルの開発、装置、試薬への多大な投資を必要としますが、アッセイが確立されると、実験的に制御されたタンパク質相互作用ネットワークを観察する高次元データを収集できます。刺激。技術的には、QMIはサンプルおよび抗体の井戸位置の慎重なピペッティングおよび追跡を必要とする。アッセイプレートを注意深くラベル付けすると、紙上の井戸の位置の詳細なテ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、QMIアッセイ開発への重要な貢献、および技術的なガイダンスと知的インプットのためのスミスとシュラム研究所の現在および元メンバーに対するテッサ・デイビスの貢献を認めたいと考えています。この仕事はNIMH助成金R01 MH113545およびR00 MH 102244によって資金提供された。
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
References
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
