मल्टीप्लेक्स्ड सह-प्रतिरक्षा का उपयोग कर प्रोटीन इंटरेक्शन नेटवर्क गतिशीलता का परिमाणीकरण
Summary
मात्रात्मक बहुसंकेत इम्यूनोवेरीफ्ट (क्यूएमआई) दो नमूनों के बीच लक्षित प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की बहुतायत में मतभेदों के संवेदनशील पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। QMI biomaterial की एक छोटी राशि का उपयोग किया जा सकता है, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर टैग की आवश्यकता नहीं है, और किसी भी पहले से परिभाषित प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
गतिशील प्रोटीन प्रोटीन बातचीत सेलुलर व्यवहार को नियंत्रित, गतिशीलता से डीएनए प्रतिकृति के लिए संकेत transduction. हालांकि, एक प्रोटीन बातचीत नेटवर्क में कई प्रोटीन के बीच गतिशील बातचीत की निगरानी तकनीकी रूप से मुश्किल है. यहाँ, हम मात्रात्मक बहुसंकेतन इम्यूनोप्रीसेप्शन (QMI) के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो उजागर द्वारा पता लगाए गए साझा परिसरों में प्रोटीन के सापेक्ष फ्लोरोसेंट माप के आधार पर प्रोटीन इंटरैक्शन में गुना परिवर्तन के मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है सतह एपिटोप (पिसेस)। QMI में, सेल lysates से प्रोटीन परिसरों microspheres पर इम्यूनोप्रिसिटायुक्त हैं, और फिर एक अलग प्रोटीन के लिए एक लेबल एंटीबॉडी के साथ जांच के क्रम में PiSCES की बहुतायत मात्रा में. इम्यूनोप्रीसेंस एंटीबॉडी विभिन्न MagBead वर्णक्रमीय क्षेत्रों के लिए संयुग्मी हैं, जो एक प्रवाह साइटोमीटर को कई समानांतर इम्यूनोप्रीफिएशन में अंतर करने की अनुमति देता है और साथ ही प्रत्येक के साथ जुड़े जांच एंटीबॉडी की मात्रा को परिमाणित करता है। QMI आनुवंशिक टैगिंग की आवश्यकता नहीं है और अन्य इम्यूनोप्रीसिप्शन तरीकों की तुलना में कम से कम biomaterial का उपयोग किया जा सकता है। QMI प्रोटीन बातचीत के किसी भी परिभाषित समूह के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और इस प्रकार अब तक टी कोशिकाओं और न्यूरॉन ग्लूटामेट synapses में संकेतन नेटवर्क की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है. परिणाम संभावित नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ नई परिकल्पना पीढ़ी के लिए नेतृत्व किया है. इस प्रोटोकॉल QMI प्रदर्शन करने के लिए निर्देश भी शामिल है, प्रारंभिक एंटीबॉडी पैनल चयन से assays चलाने और डेटा का विश्लेषण करने के लिए के माध्यम से. एक QMI परख के प्रारंभिक विधानसभा एक पैनल उत्पन्न करने के लिए एंटीबॉडी स्क्रीनिंग शामिल है, और अनुभवजन्य एक उपयुक्त lysis बफर का निर्धारण. बाद में अभिकर्मक तैयारी में MagBeads के लिए सहसंयोजक युग्मन इम्यूनोप्रीसिप्शन एंटीबॉडी, और बायोटिनलेटिंग जांच एंटीबॉडी शामिल हैं ताकि उन्हें स्ट्रेप्टाविडिन-संयोजित फ्लोरोफोर द्वारा लेबल किया जा सके। परख चलाने के लिए, lysate रात भर MagBeads के साथ मिलाया जाता है, और फिर मोती विभाजित कर रहे हैं और विभिन्न जांच एंटीबॉडी के साथ incubated, और फिर एक fluorophore लेबल, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पढ़ा. दो सांख्यिकीय परीक्षण PiSCES कि प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच काफी अलग की पहचान करने के लिए किया जाता है, और परिणाम heatmaps या नोड-एज आरेख का उपयोग कर visualized हैं.
Introduction
गतिशील प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्यक्रियाओं आणविक संकेतन cascades और गतिशील संरचनाओं है कि सबसे सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान1के कार्यात्मक आधार हैं का गठन. इन प्रक्रियाओं को अक्सर रेखीय संकेतन पथ के रूप में दर्शाया जाता है जो एकल इनपुट के आधार पर स्थिर अवस्थाओं के बीच स्विच करते हैं, लेकिन प्रयोगात्मक और मॉडलिंग डेटा स्पष्ट रूप से दर्शाते हैं कि वे एकीकृत नेटवर्क2,3केरूप में कार्य करते हैं, 4जी प्रोटीन के मामले में, विभिन्न रिसेप्टर्स अक्सर एक ही जी प्रोटीन को सक्रिय करने की क्षमता है, और एक एकल रिसेप्टर भी जी प्रोटीन5,6के एक से अधिक प्रकार सक्रिय कर सकते हैं . जी प्रोटीन वर्गों की अपेक्षाकृत छोटी संख्या के लिए आदेश में विशेष रूप से इस तरह के synaptic संचरण के रूप में सेलुलर कार्यों की एक विशाल सरणी modulate करने के लिए, हार्मोन विनियमन, और सेल प्रवास, कोशिकाओं दोनों एकीकृत और इन संकेतों में अंतर करना चाहिए4 , 5.साक्ष्य से पता चला है कि जी प्रोटीन के साथ-साथ अन्य लोगों के लिए यह संकेत विशिष्टता मुख्य रूप से पतले tuned प्रोटीन प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत और उनके लौकिक गतिशीलता1,3, के आधार पर ली जाती है 4 , 5 , 6 , 7क्योंकि संकेत नेटवर्क कई आदानों, outputs, और प्रतिक्रिया छोरों के साथ गतिशील प्रोटीन परिसरों के शामिल हैं, एक एकल क्षोभ एक सेल के शरीर क्रिया विज्ञान4 के समग्र homeostatic संतुलन को बदलने का अवसर है ,7. अब यह व्यापक रूप से सहमत है कि संकेतन एक नेटवर्क के नजरिए से जांच की जानी चाहिए ताकि बेहतर समझने के लिए कैसे कई आदानों के एकीकरण नियंत्रण स्वास्थ्य औररोग7,8में असतत सेलुलर कार्यों 9,10,11,12,13. इस के प्रकाश में, मात्रात्मक बहुसंकेतन इम्यूनोवेरीफ्ट (QMI) मध्यम throughput इकट्ठा करने के लिए विकसित किया गया था, गतिशील प्रोटीन बातचीत नेटवर्क में गुना परिवर्तन के बारे में मात्रात्मक डेटा.
क्यूएमआई एक एंटीबॉडी-आधारित परख है जिसमें सेल lysate को इम्यूनोप्रीसिप्शन एंटीबॉडी के पैनल के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जो फ्लोरोसेंट रंगों के विशिष्ट अनुपात वाले चुंबकीय मोती के साथ सहसंयोजक रूप से युग्मित होते हैं। विशिष्ट एंटीबॉडी अलग चुंबकीय मनका वर्गों के लिए युग्मित होने के लिए एक ही lysate से कई लक्ष्य प्रोटीन के एक साथ सह-प्रतिरक्षा के लिए अनुमति देता है। इम्यूनोवर्षा (आईपी) के बाद, चुंबकीय मोती को एक दूसरे के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, फ्लोरोफोर-कंजुगेटेड जांच एंटीबॉडी (या फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेटेड स्ट्रेपविडिटिन के साथ संयोजन के रूप में बायोटिनलेट्ड एंटीबॉडी)। प्रत्येक आईपी एंटीबॉडी-प्रोब एंटीबॉडी जोड़ी द्वारा मान्यता प्राप्त प्रोटीन के बीच सह-संबंध, या PiSCES (साझा परिसरों में प्रोटीन उजागर सतह epitopes द्वारा पता लगाया), तो प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया जाता है और मात्रात्मक विभिन्न के बीच तुलना में किया जा सकता है नमूना शर्तों14| चित्र 1 के उदाहरण ों यथावतः प्रोक्ता अनुप्रग अनुपयुक्त प्रोबेशनल ोंपलों के साथ चुंबकीय मोतियों का आरेख सहित क्यूएमआई परख चलाने में शामिल चरण दर्शाते हैं, जिनमें प्रतिरूपित प्रोटीन संकुलों के साथ चुंबकीय मोतियों का आरेख शामिल है, जो फ्लोरोसेंटी संयुग्मी जांच एंटीबॉडीद्वारालेबल किए गए हैं।
QMI की संवेदनशीलता प्रतिरक्षा के लिए इस्तेमाल किया चुंबकीय मोती की संख्या के सापेक्ष lysate के प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर करता है, और एक संकल्प को प्राप्त करने का पता लगाने 10% गुना परिवर्तन अन्य की तुलना में सामग्री शुरू करने की केवल एक छोटी राशि की आवश्यकता है सह-आईपीविधि14,15. उदाहरण के लिए, QMI में उपयोग की जाने वाली प्रारंभिक सामग्री की मात्रा सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख (ELISA) के लिए आवश्यक सामग्री के समान है, लेकिन एक ही QMI परख में एकाधिक इंटरैक्शन का पता लगाया जाता है. QMI 20 आईपी और 20 जांच लक्ष्य ों का उपयोग कर assays 1-5 x 105 प्राथमिक टी कोशिकाओं का उपयोग कर एक 4 मिमी त्वचा बायोप्सी से अलग किया गया है, P2 synaptomal तैयारी माउस prefrontal प्रांतस्था के एक 3 मिमी कोरोनल अनुभाग से, या 3 x 106 सुसंस्कृत माउस प्राथमिक वल्कुटीय न्यूरॉन्स14,16,17. इस संवेदनशीलता QMI सीमित उपलब्धता के साथ कोशिकाओं या ऊतक के विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाता है, इस तरह के नैदानिक नमूने के रूप में.
QMI किसी भी पहले से परिभाषित प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (बशर्ते कि एंटीबॉडी उपलब्ध हैं), और आज तक टी सेल प्रतिजन रिसेप्टर (TCR) संकेत और न्यूरॉन्स में glutamatergic synapses में प्रोटीन का एक सबसेट का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है 17 , 18.टी सेल रिसेप्टर संकेतन के अध्ययन में, QMI पहले PiSCES में उत्तेजना प्रेरित परिवर्तन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और फिर एक नियंत्रण समूह से autoimmune रोगियों भेद करने के लिए, अंतर्जात autoimmune संकेतन का पता लगाने, और अंत में उत्पन्न करने के लिए एक परिकल्पना जिसमें असंतुलित रोग-संबद्ध उप-संवद्क्षण ों का संबंध14शामिल है। हाल ही में, उसी क्यूएमआई पैनल का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि थाइमोसाइट चयन टीसीआर-संबद्ध प्रोटीन संकेतन19में गुणात्मक अंतरों के बजाय मात्रात्मक द्वारा निर्धारित किया जाता है। न्यूरॉन्स में, QMI इनपुट संकेतों के अलग प्रकार के लिए एक प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के इनपुट-विशिष्ट पुनर्व्यवस्थित का वर्णन करने के लिए एक तरीके से जो synaptic प्लास्टिक17के नए उभरते मॉडल का समर्थन करता है इस्तेमाल किया गया था. इसके अतिरिक्त, इस synaptic QMI पैनल आत्मकेंद्रित के सात माउस मॉडल में मतभेदों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, उनके PiSCES biosignatures के आधार पर उपसमूहों में मॉडल क्लस्टर, और सही एक साझा आणविक घाटे है कि पहले से अपरिचित था hypothesize मॉडल में से एक में16| एक समान दृष्टिकोण अन्य उपसमूहों है कि विभिन्न दवा उपचार के लिए प्रतिक्रिया हो सकती है के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या विशिष्ट उत्तरदायी उपसमूहों के लिए दवाओं आवंटित. QMI बुनियादी विज्ञान के अलावा निदान में संभावित अनुप्रयोगों है, रोगी उप टाइपिंग, और दवा विकास..
एक QMI एंटीबॉडी पैनल को इकट्ठा करने के लिए, प्रारंभिक एंटीबॉडी स्क्रीनिंग और चयन प्रोटोकॉल अनुभाग 1 में वर्णित हैं, नीचे. एक बार एंटीबॉडी पैनलों की पहचान कर रहे हैं, आईपी के लिए चुंबकीय मोती के लिए चयनित एंटीबॉडी के संयोजन के लिए प्रोटोकॉल, और चयनित जांच एंटीबॉडी के biotinylation के लिए, धारा 2 में वर्णित हैं. सेल या ऊतक lysates पर QMI परख चलाने के लिए प्रोटोकॉल धारा 3 में वर्णित है. अंत में, चूंकि कोई एकल प्रयोग डेटा संसाधन, विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता करने के लिए $5 x 105 अलग-अलग डेटापॉइंट, निर्देश और कंप्यूटर कोड जेनरेट कर सकता है, अनुभाग 4 में प्रदान किए गए हैं. अनुभाग 2-4 में वर्णित कार्यप्रवाह का ओवरव्यू चित्र 1में दिखाया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
QMI परख एंटीबॉडी पैनल विकास, उपकरण और अभिकर्मकों में पर्याप्त निवेश की आवश्यकता है, लेकिन एक बार परख की स्थापना की है, एक उच्च आयामी डेटा प्रोटीन बातचीत नेटवर्क देख एकत्र कर सकते हैं के रूप में वे प्रयोगा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकQMI परख विकास के लिए महत्वपूर्ण योगदान के लिए Tessa डेविस स्वीकार करना चाहते हैं, और वर्तमान और तकनीकी मार्गदर्शन और बौद्धिक इनपुट के लिए स्मिथ और Schrum प्रयोगशालाओं के पूर्व सदस्यों. इस काम NIMH अनुदान R01 MH113545 और R00 MH 102244 द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
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