שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר
Summary
פרוטוקול זה נועד להעריך את הכדאיות של דרוסופילה בכל שלב התפתחותי, מעובר למבוגר. ניתן להשתמש בשיטה כדי לקבוע ולהשוות בין הכדאיות של גנוסוגים שונים או תנאי גדילה.
Abstract
בדרוזופילה מלאנוסטר, משתמשים בכדאיות כדי לקבוע את הכושר של רקע גנטי מסוים. וריאציות Allelic יכול לגרום לאובדן חלקי או מלא של הכדאיות בשלבים שונים של התפתחות. המעבדה שלנו פיתחה שיטה להעריך את הכדאיות בדרוזופילה מעובר ועד למבוגר בוגר במלואו. השיטה מסתמכת על כימות מספר הצאצאים המצויים בשלבים שונים במהלך הפיתוח, החל מעוברים מקווקו. לאחר כימות העוברים, שלבים נוספים נספרים, כולל L1/L2, גלמים, ומבוגרים בוגרים. לאחר שנבדקו כל השלבים, ניתוח סטטיסטי כגון מבחן הצ מרובע משמש כדי לקבוע אם יש הבדל משמעותי בין מספר התחלתי של צאצאי (העוברים מקווקו) ושלבים מאוחרים יותר השיאה במספר הנצפה של מבוגרים, ובכך לדחות או לקבל את ההשערה הריקה (שמספר העוברים המקווקו יהיה שווה למספר הזחלים, הגלמים והמבוגרים הנרשמים בשלבי הפיתוח). היתרון העיקרי של השיקול הזה הוא הפשטות והדיוק שלה, כפי שהוא אינו דורש העובר לשטוף כדי להעביר אותם לבקבוקון המזון, הימנעות הפסדים משגיאות טכניות. למרות שהפרוטוקול המתואר כאן אינו מבצע בדיקה ישירה של הזחלים L2/L3, ניתן להוסיף שלבים נוספים לחשבון עבור אלה. השוואת מספר העוברים המקווקו, L1, הגלמים והמבוגרים יכולים לעזור לקבוע אם הכדאיות נחשפה במהלך השלבים L2/L3 למחקרים נוספים (השימוש במזון צבעוני מסייע לזיהוי ויזואלי של הזחלים). בסך הכל, שיטה זו יכולה לסייע לדרוזוהילה חוקרים ומחנכים לקבוע מתי הכדאיות נפגעת במהלך מחזור החיים לטוס. הערכה שגרתית של מניות באמצעות השיטה הזו יכולה למנוע הצטברות של מוטציות משניות שעלולות להשפיע על הפנוטיפ של המוטציה הבודדת המקורית, במיוחד אם המוטציות המקוריות משפיעות על הכושר. מסיבה זו, המעבדה שלנו שומרת עותקים מרובים של כל אחד שלנו מיט ime4 אללים ובודק באופן שגרתי את הטוהר של כל מניה עם שיטה זו בנוסף ניתוחים מולקולריים אחרים.
Introduction
תוחלת החיים מושפעת מגורמים גנטיים ושאינם גנטיים. בתנאי הצמיחה הסטנדרטית במעבדה בטמפרטורת החדר, המעבדה שלנו הבחין וריאציה משמעותית של כושר הכדאיות בין ime4 אללים שונים מיט הגדלים תחת תנאים זהים (איור 1 ומשלים דמויות). מחקרי הכדאיות נעשים לעתים קרובות כדי לחקור את ההשפעות של שילוב אלל מסוימים או תנאי גדילה במחקרים גנטיים באוכלוסייה1,2,3,4. עם זאת, ניתוח מפורט של הכדאיות בתוך קבוצה לא משלימה של מוטציות קשה למצוא בספרות המדעית. אלל הוא בדרך כלל מתויג “לא חיוני” אם החוקר מוצא כמה אנשים homozygous עבור זה אלל בתוך בקבוקון המזון הבתים מלאי מאוזנת5,6. עם זאת, ניתוחים מדויקים של צ’י-סקוור כדי להעריך אם ההומוזיטים האלה מתעוררות ביחס למנדון הצפוי לא מדווחים5,6. טמפרטורת מתירני ביותר עבור כל מלאי דרוסוילה היא טמפרטורת החדר (22-23 ° c) ו, עם חומרים מזינים מתאימים, מחזור החיים של הזבובים מסוג פראי לוקח כ 12 ימים כדי להשלים את7,8. כאשר משך כל שלב התפתחותי של מסוג פראי דרוסופילה מוכר7,8, השיטה המתוארת בדוח זה יכולה לשמש כדי לבחון אם המתח הדרוזוזה תחת המחקר מתאים בכל שלב בהשוואה לפקד המתאים לרקע הגנטי שנבדק. בניגוד למחקרים המתמקדים בהיבט מסוים אחד של פיתוח9, פרוטוקול זה מספק דרך מעשית להעריך את הכדאיות בשלבים התפתחותיים שונים.
במעבדה שלנו, פרוטוקול זה משמש כדי להעריך את הכדאיות של מניות כי הם חסרים עבור Drosophila ילה הסליל של Meiosis 4 (מיט ime4). מיט ime4 הוא גן חיוני10 כי מקודד rna מmethyltransferase עם תפקידים קריטיים RNA מטבוליזם ב drosophila ילה ואורגניזמים אחרים משני האחרים5,6,10, מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 . כדי להעריך במהירות את אללים הרומן של מיט ime4 שנוצר באמצעות crispr/Cas9 (דמויות משלימות), הכדאיות בנקודת קצה בוצעה כי רק הצאצא למבוגרים המיוצר בתוך בבקבוקונים של מניות מאוזנת (איור 1). חלק מהמניות המשמשות בשימוש תוארו בדוחות Dm ime4 הקודם5,6. מוטציות Homozygous הופיעו ברמות sub-Mendelian, כפי שנקבע על ידי ניתוחי צ’י מרובע (איור 1 וחומרים משלימים). כדי להעריך אם המספרים הנמוכים-מהצפוי האלה היו בגלל פחות עוברים שהונחו, או פחות עוברים מורחבים, או אובדן הכדאיות ב-L1/L2 או גלמים, הרחבנו את המעקב כדי לכלול ספירות בכל אחד מהשלבים ההתפתחותיים (איור 2, איור 3, איור 4, איור 5, איור 6, איור 7, ספרה 8ואיור 9.
כאן, אנו מתארים את השיטה באמצעות מסוג פראי (OreR) זבובים. כדי לבחון מדעית שיטה זו לשימוש עם רקעים גנטיים אחרים או מינים דרוזופילה, אנו ממליצים להשתמש ב-OreR כהפניה ולהתאים נקודות זמן לפי האורגניזם הניסיוני. הפרוטוקול הוערך עוד יותר כדי להעריך את הכדאיות של צאצאים שנוצרו על ידי חציית הבתולה פראי סוג הנקבות עם גברים מ heterozygous Dm ime4 מלאי מוטציה5,6 (איור 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
לסיכום, שיטה זו מספקת הערכה מדויקת ופשוטה של הכדאיות בדרוסופילה. הפרוטוקול כולו לוקח בערך 14 ימים להשלים. ההליך אינו דורש מיומנויות טכניות מומחה; עם זאת, העיתוי הנכון, לוח זמנים של תצפיות יומיות, וזהיר העברת אגר חשוב לדיוק ולשגות.
בנוסף למיקום של העובר דיסק ענבים-אגר-בצד למטה בבקבוקון המזון, צעד מכריע נוסף בהליך הוא העברת דיסק אגר לבקבוקון מזון לא יאוחר 48 h לאחר הסרת הצלחת אגר ענבים מן העובר אוסף מיני כלובים. העברת אגר לאחר 48 h הביא העובר ואובדן הזחלים, כנראה עקב התייבשות של הדיסק אגר. כדי לספור מעברים מסוג L2/L3, הצלחת צריכה לעבור את המספר 72 h. אם השלב הזה הוא קריטי, יש לשפוך לוחות ענבים, ולהשתמש בחדר לח למניעת התייבשות. הצלבים הוגדרו בכלובים איסוף העובר המתאימים 35 מ”מ לוחות; עם זאת, ניתן לבצע הליך זה באמצעות כלובים גדולים לאיסוף העובר גם, כגון אחד המכיל 60 מ”מ או 100 מ”מ צלחות פטרי. בקבוקי המזון חייבים להיות גדולים מספיק כדי להכיל את הגדלים האלה.
ישנם צעדים שניתן להוסיף לפרוטוקול זה. כפי שהוזכר לעיל, מעברים L2/L3 מאתגרים לכמת על צלחות בשל הזמן הנדרש ואת התייבשות פוטנציאליים של אגר. בנוסף, הזחלים הופכים ניידים מאוד על פני השטח של אגר, התחזות אתגר לספור אותם במדויק. הצבת צלחות במקרר במשך 30 דקות או הוספת כמה טיפות של הרדמה קלה (פתרון לידוקאין) על פני השטח של אגר לפני ספירת הזחלים L2/L3 יכול לעזור להאט את תנועותיו כדי לספור אותם באופן מדויק יותר. אזהרה לשינויים אלה היא שהם יכולים להחדיר משתנים (רגישות קרה, רגישות הרדמה) ולבלבל את תוצאות הכדאיות. גם בלי הצעדים האלה, באמצעות מזון צבעוני, החוקרים יכולים לכמת את הנדידה L3s/הגלמים בזמן שהם מתפשרים בצד של מבחנות המזון כדי ליזום התגלמות. מגבלה לשיטה זו היא כי היא דורשת את המבוגרים המשמשים את הצלבים כדי לשרוד להיות מורדם עם CO2 לפנוטיפים כדי להגדיר את הצלבים בכלובים איסוף העובר. מיט ime4 homozygous מוטציה זכרים לא להתאושש היטב ולמות כמה שעות לאחר התעוררות מ-CO2 טיפול. שיטות אחרות לשתק מבוגרים לצורך מיון ניתן לחקור, כגון הצבת מבחנות במקרר כמה דקות ולאחר מכן להעביר מבחנות לקרח כתוש כדי להאט את התנועה ולמיין במהירות וביעילות.
מלבד השוואת החוזקות allelic ואת ההשפעות שלהם על הכדאיות, שיטה זו יכולה לשמש כדי למסך רגישות או עמידות לתרכובות התרופות המוגדרות. שלא כמו שיטות אחרות הרעילות מורכבות המסך בתרבות התא15,16,17,18, שיטה זו משתמשת באורגניזמים שלמים, מה שהופך את הערכת ההשפעות של התפתחות קל יותר לנתח. בסיכום, שימוש בפרוטוקול זה ושינויים בו, תאפשר למדוד allelic עוצמות, כמו גם את ההשפעות של גורמים סביבתיים ותרכובות כימיות על הכדאיות של בדרוזוהילה , פוריות, פוריות, תוחלת החיים, ומשך מחזור התפתחותי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה שלנו ממומנת על ידי NIH 1R15GM1131-01 כדי CFH ו NIH PA-12-149 כדי CFH.
Materials
| Antimold additive | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
| Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
| CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
| Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
| Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
| Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
| Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
| Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
| Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
| Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
| Metal spatula (small) | Carolina | ||
| Microwave | Any | To cook grape agar | |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
| Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |
References
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. 유전학. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l’Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. 유전학. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
