질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조
Summary
타우는 세포질과 미세관을 결합하는 핵에 모두 존재하는 신경 단백질로 알츠하이머 병 관련 유전자의 변조를 포함한 틀에 얽매이지 않는 기능을 발휘합니다. 여기서, 우리는 세포질 타우에서 오는 간섭을 배제하면서 핵타우의 기능을 조사하는 방법을 설명한다.
Abstract
타우는 뉴런에서 발현되는 미세소관 결합 단백질이며, 그 주요 알려진 기능은 세포골격 안정성의 유지와 관련이 있다. 그러나, 최근의 증거는 타우가 DNA 보호, rRNA 전사, 레트로 트랜스포손의 이동성 및 구조 적 조직에 연루된 핵을 포함한 다른 세포 외 구획에도 존재한다는 것을 나타냈다. 핵균. 우리는 최근에 핵 타우가 VGluT1 유전자의 발현에 관여한다는 것을 보여주었습니다, 알츠하이머 병의 초기 단계에서 조미료 방출의 병리학적 증가를 설명할 수 있는 분자 기계장치를 건의하. 최근까지, 표적 유전자의 발현을 조절하는 핵타우의 개입은 세포질 타우의 기여의 배제 또는 다른 그 효과의 배제를 방지하는 기술적 한계로 인해 상대적으로 불확실하고 모호하게 되어 왔다. 핵 타우와 관련이없는 다운 스트림 요인. 이러한 불확실성을 극복하기 위해, 우리는 핵타우 단백질에 의해 특이적인 변조된 표적 유전자의 발현을 연구하는 방법을 개발하였다. 우리는 세포화 신호와 세포분열의 사용을 결합하는 프로토콜을 채택하여 세포질 타우 분자로부터의 간섭을 배제할 수 있게 했습니다. 가장 주목할 만한, 프로토콜은 쉽고 다른 세포 유형 및 세포 조건에서 Tau의 핵 기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용 가능한 고전적이고 신뢰할 수있는 방법으로 구성됩니다.
Introduction
핵에서 타우 단백질의 기능은 핵산1,2,3,4,5,6과밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타났기 때문에 최근 몇 년 동안 상당한 관심을 얻고 있다. 실제로, 최근 게놈 전체 연구는 타우가 생체 내에서 genic 및 intergenic DNA 서열을 결합한다는 것을 보여주었습니다7. 뉴클레올라 조직에서의 역할은8,9,10,11로제안되었다. 더욱이, 타우는 산화 및 고열 스트레스5,10,12,13,돌연변이 타우가 염색체 불안정성 및 이수성 및 이수성14,15,16에연결되는 반면, 산성 및 고열 스트레스로부터 DNA 보호에 관여하는 것으로 제안되었다.
지금까지 핵구획에서 타우의 기능을 연구하는 과제는 세포질 타우의 기여에서 핵타우의 구체적인 기여를 해부하는 어려움으로 인해 거의 해결되지 않았다. 더욱이, 핵 구획에 있는 타우 분자에 기인하는 기능은, 지금까지, 핵 타우 단백질의 직접적인 관여의 명백한 데모가 결여되기 때문에, 단지 상관관계가 있습니다. 실제로, 타우가 레트로트랜스포손의 이동성 또는 rRNA 전사 또는 DNA 보호에 11,12,17,18,19의 관여는 또한 세포질 타우의 기여 또는 핵 타우와 관련이 없는 다른 다운스트림 요인의 효과에 의해 설명될 수 있다.
여기서, 우리는 핵국극화(NLS) 또는 핵수출신호(NES)로 태그된 타우컨스0N4R의 사용과 결합된 핵구획을 분리하는 고전적인 절차를 이용하여 이 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공한다. 이 접근법은 세포질 구획에서 타우 분자의 유출로 인해 가능한 유물과 관련된 복잡한 문제를 제거합니다. 더욱이, 타우-NLS 및 타우-NES 구성은 핵 구획에서 타우 분자의 농축 또는 배제를 유도하고, 특정 기능에서 핵 타우 분자의 개입에 대한 긍정적 및 음성 적 제어를 제공한다. 이 프로토콜은 기술적으로 용이하고 타우발현(20,21)을재활성화시키는 암세포와 같은 다른 세포 유형에서 타우의 핵기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용가능한 고전적이고 신뢰할 수 있는 방법으로 구성된다. 더욱이, 그것은 다른 구획에 관련되었던 생물학 기능을 해부하기 위하여 세포질 및 핵 둘 다에 존재하는 그밖 단백질에도 적용될 수 있습니다.
Protocol
1. 세포 배양 배양 SH-SY5Y 세포(인간 신경아세포종 세포주, CRL-2266) 완전한 배지(덜베코의 변형된 이글 배지:영양 혼합물 F12 [DMEM/F-12]를 10% 태아 소 혈청[FBS], 2 mML-글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충하였다. 37 °C 및 5 %CO2에서인큐베이터에서 세포를 유지합니다. 10cm 접시에 세포를 성장하고 수렴 할 때 분할. 2. 세포 분화 SH-SY…
Representative Results
세포질 타우 단백질의 기여를 피하는 유전자 발현에서 핵타우의 영향을 해부하는 데 사용되는 전략은 도 1에도시되어 있다. 간단히, NLS 또는 NES로 태그된 타우 단백질은 각각 핵 구획에서 축적되거나 배제된다. 이러한 불균형의 기능적 효과는 VGluT1 유전자의 생성물로 측정된 유전자 발현의 변화이다. 프?…
Discussion
우리는 유전자 발현에 핵 타우 단백질의 영향을 측정하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하면 세포질 타우의 기여가 강력하게 제한됩니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포의 분화, 핵 구획에서 타우 단백질의 세포 분열 및 국소화.
먼저, 대표적인 결과 섹션에 나타난 바와 같이, RA 및 BDNF를 첨가하여 SH-SY5Y 세포의 분화는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 스쿠올라 노멀 슈페리어 (SNS14_B_DIPRIMIO 의 보조금에 의해 지원되었다; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically – The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. 생화학. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer’s Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , (2012).
- Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?. Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
Cite This Article
Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).