Vi presenterer en protokoll for bruk av et protein Microarray konstruert ved å skrive ut influensa antigener på nitrocellulose-belagte lysbilder å samtidig sonde serum for flere antistoff isotypes mot over 250 antigener fra ulike virusstammer, og dermed som tillater måling av bredden av serum antistoffer på tvers av virus under typer.
Influensa viruset er fortsatt en betydelig årsak til dødelighet over hele verden på grunn av den begrensede effektiviteten av for tiden tilgjengelige vaksiner. En viktig utfordring for utviklingen av universelle influensa vaksiner er høy antigen mangfold som følge av antigen drift. Overvinne denne utfordringen krever romanen forskning verktøy for å måle bredden av serum antistoffer rettet mot mange virusstammer over ulike antigen under typer. Her presenterer vi en protokoll for å analysere bredden av serum antistoffer mot ulike influensa virusstammer ved hjelp av et protein Microarray av influensa antigener.
Dette influensa antigen Microarray er konstruert ved utskrift renset hemagglutinin og neuraminidase antigener på en nitrocellulose-belagt membran ved hjelp av en Microarray skriver. Human Sera er inkubert på Microarray å binde antistoffer mot influensa antigener. Quantum-dot-bøyd sekundære antistoffer brukes til samtidig å detektere IgG og IgA antistoffer binding til hvert antigen på Microarray. Kvantitativ antistoff binding måles som fluorescens intensitet ved bruk av et bærbart Imager. Representative resultater er vist å demonstrere analysen reproduserbarhet i måling under type-spesifikke og kryss-reaktive influensa antistoffer i menneskelig Sera.
Sammenlignet med tradisjonelle metoder som ELISA, gir influensa antigen Microarray en høy gjennomstrømning multiplekset tilnærming i stand til å teste hundrevis av Sera for flere antistoff isotypes mot hundrevis av antigener i en kort tidsramme, og dermed har programmer i Sero-overvåking og vaksine utvikling. En begrensning er manglende evne til å skille binding antistoffer fra nøytralisere antistoffer.
Influensa viruset er ansvarlig for et tap på 20 000 000 livet-år årlig ved død eller uførhet, inkludert 1% av alle dødsfall over hele verden hvert år, med uforholdsmessig innvirkning på eldre og populasjoner i tropene og utvikling av verden1, 2,3. I tillegg til sykdommen byrden av sesongmessige epidemier, fremveksten av romanen influensa stammer via genetiske re-sortiment enten naturlig i felles verter eller kunstig for bioterrorisme kan føre til verdensomspennende pandemier med rask spredning og høy dødelighet 4 andre priser , 5. mens mange influensa vaksiner er for tiden tilgjengelig, er deres effektivitet begrenset av under type spesifisitet6, skape behov for å utvikle universelle influensa vaksiner som gir langvarig immunitet mot flere virus stammer7.
En viktig utfordring for utviklingen av universelle influensa vaksiner er høy antigen mangfold på tvers av stammer. Den antigen spesifisitet av aktuelle vaksiner kombinert med antigen variasjon av sirkulerende virus skaper en konflikt mellom vaksine stammer og sirkulerende stammer. Dette gir en evolusjonær fordel favoriserer ytterligere genetisk drift bort fra vaksine stammer under en epidemi, begrense vaksine effekt ofte til mindre enn 50%8,9. En ekstra kilde til antigen ikke samsvarer er egg-adaptive viral mutasjoner generert under vaksine produksjon, noe som fører til antistoffer som binder dårlig til sirkulerende virus10,11.
Å overvinne denne utfordringen med høy antigen mangfold vil kreve nye forskningsverktøy for å karakterisere bredden av eksisterende og elicited immunresponser på tvers av klinisk relevante antigen varianter i serum og slimhinne prøver. For tiden tilgjengelige metoder, inkludert hemagglutination hemming (HAI), microneutralization (MN), og tradisjonelle ELISA, er begrenset til å påvise antistoffer mot en enkelt virus belastning om gangen, slik at deres bruk for påvisning av flere antistoff isotypes mot flere virusstammer raskt eksos tilgjengelig kliniske prøven og laboratorie ressurser. Videre, HAI og MN forlange bo virus kulturen det er bare anvendelig inne spesialisert laboratorium.
Protein Microarrays, potensielt bestående av opptil tusenvis av antigener trykt på nitrocellulose-belagte lysbilder som vist i figur 1, kan fylle dette behovet12. Disse Microarrays kan produseres og analysert i en høy gjennomstrømming måte mens forbruker små mengder av kliniske prøver for å bestemme kvantitative antistoff isotype/under type nivåer mot hvert enkelt antigen på matrisen. Denne tilnærmingen til antigen funn har blitt brukt til diagnostiske og vaksine utvikling mot flere smittsomme patogener13. Hittil har vi produsert protein Microarrays for over 35 patogener inkludert over 60 000 totalt uttrykt proteiner og brukte dem til å granske over 30 000 menneskelige Sera fra infiserte og kontrollere individer. En nylig utviklet Portable Imaging plattform for Microarray lysbilder har gjort denne metodikken mer tilgjengelig for sluttbrukeren14.
Bygge på omfattende tidligere arbeid av flere bidragsytere i feltet15,16,17,18,19, et influensa protein Microarray ble nylig utviklet som inneholder over 250 renset hemagglutinin (ha) antigen varianter med representasjon av alle 18 under typer12,20. Ved hjelp av denne metodikken, ble en naturlig influensa infeksjon vist å generere bredt reaktive IgG og IgA antistoffer mot phylogenetically relaterte HA undergrupper, mens en intramuskulær influensa vaksinasjon generert bare under type-spesifikke IgG antistoffer21. Men å legge en adjuvant som aktiverer toll-lignende reseptorer til influensa vaksiner ble vist å utvide elicited IgG antistoffrespons over HA undergrupper i dyrestudier22.
Denne Microarray brukes for tiden til å granske Sera samlet inn fra en potensiell kohortstudie av studenter som ble fulgt for influensa infeksjon. Her er metodikken av influensa antigen Microarray med demonstrasjon av analysen reproduserbarhet for å oppdage under type-spesifikke og kryss-reaktive antistoffer i en undergruppe av prøver fra denne studien er rapportert.
Influensa antigen Microarray protokollen er beskrevet her er tilpasningsdyktig til ethvert prosjekt som krever analysere antistoff svar på mange antigener. Den Microarray plattformen kan brukes med alle ønskede sett av protein antigener uttrykt i ethvert system som kan oppnå 0,1 mg/mL eller høyere yield med eller uten rensing som tidligere beskrevet12. Hvis ikke-renset protein antigener (f. eks, uttrykt i in vitro transkripsjon og oversettelse system) er direkte brukt til å skrive ut Microarrays, komponenter av protein uttrykk system (f. eks, e. coli lysat) bør legges 1:10 til blokkering buffer som brukes for fortynning av Sera og kvalitetskontroll antistoffer for å blokkere eventuelle antistoffer rettet mot disse komponentene. Lysbilde konfigurasjoner er tilgjengelige med et lavere antall større pads på hvert lysbilde for å imøtekomme et høyere antall antigener per array. For denne studien, brukte vi en GeneMachines OmniGrid 100 Microarray skriver som benytter pinner som direkte kontakt nitrocellulose overflaten til innskudd flekker på array. Selv om denne Microarray skriveren ikke lenger er kommersielt tilgjengelig, kan andre kommersielt tilgjengelige Microarray skrivere brukes i denne protokollen, men kan kreve tilpassede pins (enten kontakt eller ikke-kontakt) og programvare og bør ha tilstrekkelig spot oppløsning og kompatibilitet med lysbilder og Imager. Avhengig av reaktivitet av Sera, kan fortynninger fra 1:50 til 1:400 brukes. Serum fri buffer kan brukes som en negativ kontroll, mens monoklonale antistoffer kjent for å binde til antigen kan brukes som en positiv kontroll.
Brukere bør være klar over noen feilsøkingsproblemer. Formålet med kvalitetskontroll kontrollen med antistoffer mot hans tag er å se etter eventuelle antigener som utskriften ikke var vellykket. Eventuelle flekker som konsekvent gir lavt signal i kvalitetskontroll kontroll av flere matriser sannsynligvis representerer utilstrekkelig antigen skrives ut. Mulige årsaker inkluderer aggregering eller nedbør eller antigen i kilde plate eller dårlig kontakt mellom utskrift PIN og Microarray lysbilde på grunn av variabel tykkelse av nitrocellulose pad. På dette punktet, gjør vi ikke utføre analysen normalisering basert på kvantitative resultater av kvalitetskontroll sjekk, gitt at den oppdagede bindingen av anti-hans antistoffer kan bli påvirket av tilgjengeligheten av denne koden, som avhenger av 3-dimensjonale konformasjon spesifikke for hvert antigen.
Influensa antigen Microarray gir flere fordeler fremfor tradisjonelle metoder som ELISA og er komplementære til funksjonelle analyser som HAI og MN. Den 16-pad protein Microarray er en prøve-sparing teknologi med kapasitet til å måle antistoffer av flere isotypes samtidig mot ca 300 antigener fra 1 μL av serum. Antall antigener kan økes til tusener ved å redusere antall pads per slides. Den multiplekset analysen sparer også personell tid og forbruksressurser, gitt at hundrevis av Sera kan analysert for antistoffer i 2 dager, og alle materialer enn lysbilder og reagenser er gjenbrukbare så ikke generere store mengder plastavfall.
Selv om Microarray skrivere ikke kan distribueres bredt, kan Microarray lysbilder skrives ut på et sentralt sted og deretter transporteres til sluttbrukeren for undersøkelser. Det eneste utstyret som kreves for undersøkelser er den lave kostnader og bærbare Imager. Målet med å spre denne protokollen er å gjøre utnyttelse av denne teknikken mer utbredt.
De viktigste begrensningene av influensa antigen Microarray er manglende evne til å karakterisere funksjonen og Kinetics av oppdagede antistoffer. Microarray registrerer et polyklonale sett med bindings antistoffer for hvert antigen. Disse antistoffene kanskje eller kanskje ikke være funksjonell inne nøytralisere virus inne HAI og MN analyser. Imidlertid, HAI og MN analyser forlange bo virus kulturen med forbundet nød for spesialisert fasiliteter med høy-plan flate biosafety skap å test for Antistoffene imot avian undergrupper av influensa, mens derimot proteinet Microarray er ikke innvolvere bo virus komponentene slik at de kan brukes i et hvilket som helst grunnleggende laboratorium. Med hensyn til bindende Kinetics, en enkelt fortynning av serum analysert med en matrise som inneholder en enkelt konsentrasjon av hvert antigen gir et enkelt datapunkt, som representerer en sammensatt av kvantitet og affinitet summert over alle antistoffer som binder seg til antigen . For å fullt ut løse antigen-antistoff bindende Kinetics, flere antigen konsentrasjoner og/eller seriell fortynninger av Sera er nødvendig.
Til tross for disse begrensningene er influensa antigen Microarray et nyttig verktøy for å karakterisere bredden av influensa antistoffer over antigen landskapet som kan utfylle funksjonelle analyser som er mer begrenset i gjennomstrømning og tilgjengelighet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne Prof. Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) for å samle den menneskelige Sera under University of Maryland IRB protokollen #313842 finansiert av DARPA N66001-2-4015 P00001. Forfatterne vil også erkjenne Prof. Florian Krammer (Icahn School of Medicine, Mt. Sinai, NY, USA) for å gi trimerized HA og NA antigener finansiert av ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan er delvis støttet av National Center for Research Resources og National Center for fremmarsj translational Sciences, National Institutes of Health, gjennom stipend KL2 TR001416. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle utsikten over NIH.
16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |