Vi præsenterer en protokol for anvendelse af et protein mikrosystem, der er konstrueret ved at udskrive influenza antigener på nitrocellulose belagte slides til samtidig sonde serum for flere antistof isotyper mod over 250 antigener fra forskellige virusstammer, således tillader måling af bredden af serumantistoffer på tværs af virusundertyper.
Influenzavirussen er fortsat en væsentlig årsag til dødelighed på verdensplan på grund af den begrænsede effektivitet af de aktuelt tilgængelige vacciner. En central udfordring for udviklingen af universelle influenzavacciner er en høj antigen variation som følge af antigene drift. At overvinde denne udfordring kræver nye forskningsværktøjer til at måle bredden af serumantistoffer rettet mod mange virusstammer på tværs af forskellige antigene undertyper. Her præsenterer vi en protokol til analyse af bredden af serumantistoffer mod forskellige influenzavirusstammer ved hjælp af et protein mikroarray af influenza antigener.
Dette influenza antigen mikroarray er konstrueret ved at udskrive renset hemagglutinin og neuraminidaseantigener på en nitrocellulose belagt membran ved hjælp af en microarray printer. Humane sera inkuberet på mikrosystemet for at binde antistoffer mod influenza antigener. Quantum-dot-konjugerede sekundære antistoffer anvendes til samtidig påvisning af IgG-og IgA-antistoffer, der binder sig til hvert antigen på mikrosystemet. Kvantitativ antistof binding måles som fluorescens intensitet ved hjælp af en bærbar Imager. Repræsentative resultater viser, at analysen er reproducerbar ved måling af subtype-specifikke og krydsreaktive influenza antistoffer i humane sera.
Sammenlignet med traditionelle metoder som ELISA, giver influenza antigen microarray en høj gennemløb multiplexed tilgang i stand til at teste hundredvis af sera for flere antistof isotyper mod hundredvis af antigener i en kort tidsramme, og dermed har anvendelser inden for sero-overvågning og vaccine udvikling. En begrænsning er den manglende evne til at skelne bindende antistoffer fra neutraliserende antistoffer.
Influenzavirus er ansvarlig for et tab på 20.000.000 leveår årligt ved døden eller handicap, herunder 1% af alle dødsfald på verdensplan hvert år, med uforholdsmæssige konsekvenser for ældre og befolkninger i troperne og udviklingslandene1, 2,3. Ud over sygdomsbyrden af sæsonmæssige epidemier, fremkomsten af nye influenzastammer via genetisk re-sortiment enten naturligt i fælles værter eller kunstigt for bioterrorisme kan føre til verdensomspændende pandemier med hurtig spredning og høj dødelighed 4 , 5. mens talrige influenzavacciner i øjeblikket er tilgængelige, er deres effektivitet begrænset af subtype specificitet6, hvilket skaber behovet for at udvikle universelle influenzavacciner, der giver langvarig immunitet mod flere virus stammer7.
En central udfordring for udviklingen af universelle influenzavacciner er høj antigen mangfoldighed på tværs af stammer. Den antigene specificitet af nuværende vacciner kombineret med antigene variation af cirkulerende vira skaber en uoverensstemmelse mellem vaccinestammer og cirkulerende stammer. Dette giver en evolutionær fordel favoriserer yderligere genetisk drift væk fra vaccinestammer under en epidemi, begrænse vaccinens effektivitet ofte til mindre end 50%8,9. En ekstra kilde til antigen mismatch er ægadaptiv viral mutationer genereret under vaccine fremstilling, som fører til antistoffer, der binder dårligt til cirkulerende vira10,11.
Overvinde denne udfordring af høj antigene mangfoldighed vil kræve nye forskningsværktøjer til at karakterisere bredden af præ-eksisterende og fremkaldt immunrespons på tværs af klinisk relevante antigene varianter i serum og slimhinde prøver. Aktuelt tilgængelige metoder, herunder hæmagglutinations hæmning (HAI), mikroneutralisering (MN) og traditionel ELISA, er begrænset til påvisning af antistoffer mod en enkelt virusstamme ad gangen, så deres anvendelse til påvisning af flere antistof isotyper mod flere virusstammer hurtigt udstøde tilgængelige kliniske prøve og laboratorieressourcer. Desuden, HAI og MN kræver levende virus kultur, der kun er tilgængelig i specialiserede laboratorier.
Protein mikrosystemer, der potentielt består af op til tusinder af antigener, som er trykt på nitrocellulose belagte slides som vist i figur 1, kan udfylde dette behov12. Disse mikroarrays kan produceres og probed i en høj gennemløb måde, mens forbrugende små mængder af klinisk prøve til at bestemme kvantitative antistof isotype/subtype niveauer mod hvert enkelt antigen på array. Denne tilgang til antigen opdagelse er blevet anvendt til diagnosticering og vaccine udvikling mod flere infektiøse patogener13. Til dato har vi produceret protein mikroarrays for over 35 patogener, herunder over 60.000 samlede udtrykte proteiner og brugte dem til at sonde over 30.000 humane sera fra inficerede og kontrol individer. En nyligt udviklet Portable Imaging platform for microarray slides har gjort denne metode mere tilgængelig for slutbrugeren14.
På bygge på omfattende tidligere arbejde af flere bidragydere i feltet15,16,17,18,19, et influenza protein mikroarray blev for nylig udviklet, der indeholder over 250 renset hemagglutinin (ha) antigene varianter med repræsentation af alle 18 undertyper12,20. Ved hjælp af denne metode blev en naturlig influenza infektion påvist at generere stort set reaktive IgG-og IgA-antistoffer mod Phylogenetisk relaterede HA-undertyper, mens en intramuskulær influenzavaccination kun genererede subtype-specifik IgG antistoffer21. Det blev imidlertid påvist, at tilføjelse af et adjuvans, der aktiverer bompenge lignende receptorer for influenzavacciner, udvider det fremkaldte IgG-antistofrespons på tværs af HA-undertyper i dyrestudier22.
Dette mikroarray bruges i øjeblikket til at sonde sera indsamlet fra en prospektiv kohorteundersøgelse af universitetsstuderende, der blev fulgt for influenza infektion. Her rapporteres metodologien for influenza antigen-mikrosystemet med påvisning af analysens reproducerbarhed til påvisning af subtype-specifikke og krydsreaktive antistoffer i en delmængde af prøver fra dette studie.
Den influenza antigen microarray protokol beskrevet her er tilpasningsdygtig til ethvert projekt, der kræver at analysere antistofrespons på mange antigener. Microarray platformen kan anvendes med alle ønskede sæt af protein antigener udtrykt i ethvert system, der kan opnå 0,1 mg/mL eller højere udbytte med eller uden rensning som tidligere beskrevet12. Hvis ikke-rensede protein antigener (f. eks. udtrykt i in vitro-transskription og oversættelsessystem) anvendes direkte til at udskrive mikroarrays, bør komponenter af protein ekspressionssystemet (f. eks. e. coli -lysat) tilsættes 1:10 til blokerende buffer, der anvendes til fortynding af sera og kvalitetskontrol antistoffer for at blokere eventuelle antistoffer mod disse komponenter. Slide konfigurationer er tilgængelige med et lavere antal større puder på hver slide til at rumme et højere antal antigener per array. Til denne undersøgelse, vi brugte en GeneMachines OmniGrid 100 microarray printer, der udnytter stifter, der direkte kontakt nitrocellulose overflade til at deponere pletter på arrayet. Mens denne microarray printer ikke længere er kommercielt tilgængelig, kan andre kommercielt tilgængelige mikroarray printere bruges i denne protokol, men kan kræve brugerdefinerede Pins (enten kontakt eller ikke-kontakt) og software og bør have tilstrækkelig spot opløsning og kompatibilitet med slides og Imager. Afhængigt af reaktivitet af sera kan der anvendes fortyndinger fra 1:50 til 1:400. Serum-fri buffer kan bruges som en negativ kontrol, mens monoklonale antistoffer, der vides at binde til antigen, kan bruges som en positiv kontrol.
Brugerne skal være opmærksomme på nogle få fejlfindingsproblemer. Formålet med kvalitetskontrol kontrollen ved hjælp af antistoffer til hans tag er at kontrollere for eventuelle antigener, som udskrivningen ikke lykkedes. Enhver pletter, der konsekvent giver lavt signal i kvalitetskontrol kontrol af flere arrays sandsynligvis repræsenterer utilstrækkelige antigen trykt. Mulige årsager omfatter sammenlægning eller udfældning eller antigen i kilde pladen eller dårlig kontakt mellem trykning PIN og microarray slide på grund af variabel tykkelse af nitrocellulose pad. På dette tidspunkt udfører vi ikke analyse normalisering baseret på kvantitative resultater af kvalitetskontrol kontrollen, da den detekterede binding af anti-hans antistoffer kan påvirkes af tilgængeligheden af dette tag, som afhænger af den 3-dimensionelle kropsbygning specifikke for hvert antigen.
Influenza antigen microarray giver flere fordele i forhold til traditionelle metoder som ELISA og supplerer funktionelle assays som HAI og MN. Det 16-pad protein mikroarray er en prøve besparende teknologi med kapacitet til at måle antistoffer af flere isotyper samtidig mod ca. 300 antigener fra 1 μL serum. Antallet af antigener kan øges til de tusinder ved at reducere antallet af puder pr dias. Den multiplexed assay sparer også personale tid og forbrugs ressourcer, da hundredvis af sera kan probed for antistoffer i 2 dage, og alle andre materialer end lysbilleder og reagenser er genanvendelige så ikke genererer store mængder af plastaffald.
Mens microarray-printere ikke kan distribueres bredt, kan mikroarray-slides udskrives på et centralt sted og derefter transporteres til slutbrugeren til sondering. Det eneste nødvendige udstyr til sondering er den billige og bærbare Imager. Målet med at udbrede denne protokol er at gøre udnyttelsen af denne teknik mere udbredt.
De vigtigste begrænsninger af influenza antigen microarray er den manglende evne til at karakterisere funktion og kinetik af de fundne antistoffer. Mikrosystemet detekterer et polyklonal sæt bindende antistoffer for hvert antigen. Disse antistoffer kan eller kan ikke være funktionelle i neutraliserende virus i HAI og MN assays. Men HAI og MN assays kræver levende virus kultur med tilhørende behov for specialiserede faciliteter med højt niveau biosikkerhedskabinetter at teste for antistoffer mod aviær undertyper af influenza, hvorimod protein mikrosystemet ikke involverer levende virus komponenter, så kan udnyttes i ethvert grundlæggende laboratorium. Med hensyn til bindende kinetik, en enkelt fortynding af serum probed med en matrix, der indeholder en enkelt koncentration af hvert antigen giver et enkelt datapunkt, som repræsenterer en sammensat mængde og affinitet summeres over alle antistoffer, der binder sig til antigen . For fuldt ud at løse antigen-antistof-bindings kinetikken kræves der flere antigen koncentrationer og/eller serielle fortyndinger af sera.
På trods af disse begrænsninger, influenza antigen microarray er et nyttigt redskab til at karakterisere bredden af influenza antistoffer på tværs af det antigene landskab, der kan supplere funktionelle assays, der er mere begrænset i gennemløb og tilgængelighed.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Prof. Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) til indsamling af humane sera under University of Maryland IRB-protokollen #313842 finansieret af DARPA N66001-18-2-4015 P00001. Forfatterne vil også gerne anerkende Prof. Florian krammer (Icahn School of Medicine, MT. Sinai, NY, USA) for at levere trimerized HA og NA antigener finansieret af ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan er delvist støttet af det nationale center for forskning ressourcer og National Center for fremme translational Sciences, nationale institutter for sundhed, gennem Grant KL2 TR001416. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af NIH.
16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |