原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養
Summary
ここでは、HIVに感染した個体および健全なコントロールからヒト一次単球を分離、培養、トランスフェクション、および区別するための最適化されたプロトコルです。
Abstract
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、1990年代半ばに併用抗レトロウイルス療法(cART)が導入されたにもかかわらず、依然として大きな健康上の懸念事項である。抗レトロウイルス療法は、効率的に全身性ウイルス負荷を低下させ、正常なCD4+T細胞数を復元するが、それは完全に機能的な免疫系を再構成しない。cARTを受けているHIV感染者の機能不全免疫系は、免疫活性化、免疫細胞の早期老化、または持続的な炎症によって特徴付けられる。これらの状態は、HIV感染に関連する併発因子と共に、細胞および動物モデルでは容易に再現できない疾患に複雑さを加える。これらの患者における免疫機能障害の根底にある分子事象を調べるために、インビトロでヒト一次単球を培養および操作するシステムをここに提示する。具体的には、このプロトコルは、cARTを受けているHIV感染個体から得られる一次CD14+単球の培養およびトランスフェクション、ならびにHIV陰性対照から可能である。この方法は、単球および単球由来マクロファージの単離、培養、およびトランスフェクションを含む。市販のキットと試薬が採用されている間、このプロトコルは、miRNA模倣および阻害剤およびsiRNAを用いた単球の付着およびトランスフェクションを成功させるための重要なヒントと最適化された条件を提供する。
Introduction
ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)感染は重度の免疫機能障害を引き起こし、日和見感染や後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こす可能性がある。cARTを受けているHIV感染患者は、ウイルス負荷が低く、正常なCD4+T細胞数を特徴とするが、免疫系の機能はこれらの個体において損なわれ得るが、癌を発症するリスクの増加に関連する機能不全免疫応答につながる。cART上のHIV患者における免疫機能障害のメカニズムはほとんど未知のままである。したがって、患者由来の免疫細胞を特徴付け、その生物学と機能を調べるのは、現在のHIV研究の重要な要素です。
単球およびマクロファージは免疫応答の主要な調節剤であり、HIV感染において基本的な役割を果たす2,3,4,5.本質的に異種およびプラスチックは、マクロファージを広く古典的に活性化(M1)または代替活性化(M2)に分類することができる。この一般的な分類は実験条件を設定する際に必要であるが、マクロファージの偏光状態は、種々のサイトカイン6、7、8、9によって逆転してもよい。いくつかの研究は、単球および樹状細胞に対するHIV感染の影響を調査しているが、単球媒介応答の分子詳細はほとんど不明である6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.免疫細胞の調節および機能に関与する因子の中で、microRNA(miRNA)は、遺伝子発現後に転写的に調節する短い非コードRNA、主要な細胞経路(すなわち、増殖、分化、発達、およびアポトーシス)20の文脈において重要な役割を果たすることが示されている。これらの分子は、マクロファージ21の機能的分極化を指示するために不可欠な転写因子の重要な調節因子として記載されている。cARTを受けているHIV感染者からの単球におけるmiRNAの潜在的な役割が調査されているが、現場での進歩は、はるかに多くの作業を必要とする22、23、24、25、26。本論文では、HIVに感染した患者と対照からmiRNAとsiRNAを原発性ヒト単球にトランスフェクトする最適化された方法について論じる。
このプロトコルは、技術的な手順の連続性は臨床サンプルを扱うときに不要な実験変数を排除するのに役立つため、市販の試薬およびキットに依存しています。それにもかかわらず、この方法は、重要なヒント(すなわち、プレートへの細胞の付着を促進するために無血清媒体を用いためっきまたは短時間のインキュベーションの細胞数)を提供する。さらに、このプロトコルで使用される偏光条件は、公開された作品27、28、29に由来する。
Protocol
以下に説明するすべての方法は、ルイジアナ州立大学健康科学センターニューオーリンズ機関審査委員会によって承認されています.インフォームド・コンセントを得た後、すべての血液を採取した。 注:全手順は、生物学的材料の処理に注意が必要になるように、バイオセーフティレベル2(BSL2)施設の滅菌条件下で行われます。特に、各工程は、バイオセーフティキャビ?…
Representative Results
記載された手順を用いて、HIV感染者および健康なドナーからの原発性ヒト単球を単離した。ここで提示されたすべてのデータは、低い(<20コピー/mL)または検出不能なウイルス負荷と通常のCD4+T細胞数を有するcARTを受けているHIV+被験者から得られた。単離直後に細胞を染色し、フローサイトメトリーを行い、細胞集団の純度を確認した。結果は、>97%の?…
Discussion
提示されたプロトコルは、単球およびマクロファージを研究するためのモデルとしてHIV感染被験者からの一次細胞の使用を示す。HIV+cARTを受けている患者は、何年も感染症と共に生きており、また、侵害された免疫系に関連する他の共感染を持つことができます。HIV慢性感染の存在下で免疫調節を研究するために、細胞を患者から直接採取した。miRNAが細胞の発達と分化に大きな役割?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、患者サンプルを提供するためのHIV臨床/腫瘍バイオレポジトリコアと、フローサイトメトリー分析を提供するための細胞免疫学代謝コアに感謝したいと考えています。このプロジェクトは、NIH P20GM121288とP30GM114732によって資金提供されました。
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. 암 연구학. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
Cite This Article
Plaisance-Bonstaff, K., Faia, C., Wyczechowska, D., Jeansonne, D., Vittori, C., Peruzzi, F. Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes. J. Vis. Exp. (154), e59967, doi:10.3791/59967 (2019).