בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד, culturing, העברה, וההבחנה העיקרי האנושי מונוציטים מאנשים נגועים בריאים ושליטה בריאה.
Abstract
נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נותר חשש בריאותי גדול למרות המבוא של טיפול תרופתי משולב (עגלה) באמצע שנות ה-90. בעוד טיפול תרופתי ביעילות מורידה עומס נגיפי מערכתית ומשחזר רגיל CD4+ T ספירות תאים, זה לא מהווה מחדש מערכת חיסונית תפקודית לחלוטין. מערכת חיסונית לקוי באנשים שנדבקו ב-HIV שעברו עגלה עשוי להיות מאופיין על ידי הפעלה חיסונית, הזדקנות מוקדמת של תאים חיסוניים, או דלקת מתמשכת. תנאים אלה, יחד עם גורמי הצעת מחלה הקשורים לזיהום HIV, להוסיף מורכבות למחלה, אשר לא ניתן לשכפל בקלות במודלים סלולריים ובעלי חיים. כדי לחקור את האירועים המולקולריים בבסיס תפקוד המערכת החיסונית של חולים אלה, מערכת לתרבות ולתמרן מונוציטים הראשי האנושי בתוך מבחנה מוצג כאן. באופן ספציפי, הפרוטוקול מאפשר את התרבות ואת העיבוד של הראשי CD14+ מונוציטים שהתקבלו מאנשים נגועים ב-hiv שעברו עגלה, כמו גם מפקדים hiv-שלילי. השיטה כרוכה בבידוד, תרבות והעברה של מקרופאגים מונוציטים ובעלי בייט. בעוד קיטים הזמינים מסחרית וריאגנטים מועסקים, הפרוטוקול מספק עצות חשובות ותנאים ממוטבים לדבקות מוצלחת והעברה של מונוציטים עם מדבקות miRNA ו מעכבי כמו גם עם siRNAs.
Introduction
נגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1) זיהום גורם לתפקוד המערכת החיסונית חמורה, אשר יכול להוביל לזיהומים אופורטוניסטים ולרכוש תסמונת הכשל החיסוני (איידס). למרות חולי איידס שעברו עגלה מאופיינים העומסים ויראלי נמוך CD4+ T תא ספירות, תפקוד של המערכת החיסונית ניתן להתפשר על אנשים אלה, המוביל לתגובה חיסונית לקוי כי כבר קשור לסיכון מוגבר לפתח סרטן1. המנגנונים של תפקוד המערכת החיסונית בחולים HIV על עגלת להישאר במידה רבה לא ידוע. לכן, אפיון תאים חיסוניים שמקורם בחולים וחקירת הביולוגיה והתפקוד שלהם הוא מרכיב קריטי של מחקר האיידס הנוכחי.
מונוציטים ו מקרופאגים הם הרגולטורים המפתח של תגובות החיסון ולשחק תפקידים בסיסיים בזיהום HIV2,3,4,5. הטרוגנית ופלסטיק בטבע, מקרופאגים ניתן לסווג באופן נרחב להפעלה קלאסי (M1) או מופעל לחילופין (M2). בעוד סיווג כללי זה הכרחי בעת הגדרת תנאים ניסיוניים, הסטטוס הפולריזציה של מקרופאגים ניתן להפוך על ידי מגוון של ציטוקינים6,7,8,9. למרות מספר מחקרים חקרו את ההשפעות של זיהום האיידס על התאים המונולוציטים והדנדריטים, פרטים מולקולריים של תגובות מונוציט מתווכת הם בעיקר לא ידוע6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. בין הגורמים המעורבים ברגולציה ותפקוד התא החיסונית, microRNAs (miRNAs), קצר שאינו קידוד RNAs שלאחר ההמרה לווסת ביטוי גנים, הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהקשר של מסלולים סלולריים עיקריים (כלומר, צמיחה, בידול, פיתוח, ו אפופטוזיס)20. מולקולות אלה תוארו כרגולטורים חשובים של שעתוק גורמים חיוניים להכתיב את הקיטוב הפונקציונלי של מקרופאגים21. התפקיד הפוטנציאלי של mirnas במונציטים מאנשים נגועים באיידס שעברו עגלה נחקר, אבל ההתקדמות בתחום דורש עבודה הרבה יותר22,23,24,25,26. נייר זה דן שיטה ממוטבת כדי transfect miRNAs ו siRNAs לתוך מונוציטים האנושי העיקרי של חולי איידס ופקדים.
פרוטוקול זה מסתמך על ריאגנטים וערכות זמינים מסחרית, כמו המשכיות בהליך הטכני מסייע למנוע משתנים ניסיוניים מיותרים כאשר עובדים עם דגימות קליניות. עם זאת, השיטה מספקת טיפים חשובים (כלומר, מספר התאים מצופה או הדגירה קצר עם מדיה ללא סרום כדי לקדם את הדבקות של תאים לצלחת). בנוסף, התנאים הפולריזציה המשמשים בפרוטוקול זה נגזרים מהעבודה שפורסמה27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג ממחיש את השימוש בתאים הראשוניים של הנושאים נגועים HIV כמודל לחקר מונוציטים מקרופאגים. HIV+ חולים שעברו עגלה לחיות עם זיהום במשך שנים מרובות יכול להיות גם שיתוף זיהומים אחרים הקשורים מערכת חיסונית פרוצים. כדי ללמוד האימונומודולזילציה בנוכחות של זיהום HIV כרונית, תאים נקצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ליבה של HIV קליני/הגידול Biore, הליבה למתן דגימות החולה והליבה מטבוליזם של הסלולר לאספקת זרימה cy, לנסות ניתוח. פרויקט זה מומן על ידי NIH P20GM121288 ו-P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. 암 연구학. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
