Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten
Summary
Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.
Abstract
Trotz der Einführung einer kombinierten antiretroviralen Therapie (cART) Mitte der 1990er Jahre ist das Humanimmundefizienzvirus (HIV) nach wie vor ein großes Gesundheitsproblem. Während die antiretrovirale Therapie die systemische Viruslast effizient senkt und die normale CD4+ T-Zellzahl wiederherstellt, stellt sie kein vollständig funktionierendes Immunsystem wieder her. Ein dysfunktionales Immunsystem bei HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, kann durch Immunaktivierung, frühe Alterung von Immunzellen oder anhaltende Entzündungen gekennzeichnet sein. Diese Bedingungen, zusammen mit komorbiden Faktoren im Zusammenhang mit HIV-Infektion, erhöhen die Komplexität der Krankheit, die nicht leicht in Zell- und Tiermodellen reproduziert werden kann. Um die molekularen Ereignisse zu untersuchen, die der Immunfunktionsstörung bei diesen Patienten zugrunde liegen, wird hier ein System zur Kultur und Manipulation menschlicher Primärmonozyten in vitro vorgestellt. Insbesondere ermöglicht das Protokoll die Kultur und Transfektion von primären CD14+ Monozyten, die von HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, sowie von HIV-negativen Kontrollen erhalten werden. Die Methode umfasst Isolation, Kultur und Transfektion von Monozyten und monozytenabgeleiteten Makrophagen. Während handelsübliche Kits und Reagenzien eingesetzt werden, bietet das Protokoll wichtige Tipps und optimierte Bedingungen für die erfolgreiche Haftung und Transfektion von Monozyten mit miRNA-Mimik und Inhibitoren sowie mit siRNAs.
Introduction
Eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 (HIV-1) verursacht eine schwere Immunfunktionsstörung, die zu opportunistischen Infektionen und erworbenen Immunschwächesyndromen (AIDS) führen kann. Obwohl HIV-infizierte Patienten, die sich cART unterziehen, durch geringe Viruslasten und normale CD4+ T-Zellzahlen gekennzeichnet sind, kann die Funktion des Immunsystems bei diesen Personen beeinträchtigt werden, was zu einer dysfunktionalen Immunantwort führt, die mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Krebs verbunden ist1. Die Mechanismen der Immunfunktionsstörung bei HIV-Patienten auf cART bleiben weitgehend unbekannt. Daher ist die Charakterisierung von immunbasierten Immunzellen durch Patienten und die Untersuchung ihrer Biologie und Funktion ein kritischer Bestandteil der aktuellen HIV-Forschung.
Monozyten und Makrophagen sind wichtige Regulatoren von Immunantworten und spielen eine grundlegende Rolle bei der HIV-Infektion2,3,4,5. Heterogen und plastisch können Makrophagen grob in klassisch aktiviert (M1) oder alternativ aktiviert (M2) klassifiziert werden. Während diese allgemeine Klassifizierung bei der Einrichtung experimenteller Bedingungen notwendig ist, kann der Polarisationsstatus von Makrophagen durch eine Vielzahl von Zytokinen6,7,8,9umgekehrt werden. Obwohl mehrere Studien die Auswirkungen einer HIV-Infektion auf Monozyten und dendritische Zellen untersucht haben, sind molekulare Details von monozytenvermittelten Reaktionen weitgehend unbekannt6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Unter den Faktoren, die an der Immunzellregulation und -funktion beteiligt sind, haben sich gezeigt, dass microRNAs (miRNAs), kurze nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression posttranscriptativ regulieren, eine wichtige Rolle im Kontext wichtiger zellulärer Pfade spielen (d. h. Wachstum, Differenzierung, Entwicklung und Apoptose)20. Diese Moleküle wurden als wichtige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren beschrieben, die für die Diktat der funktionellen Polarisation von Makrophagen21unerlässlich sind. Die potenzielle Rolle von miRNAs bei Monozyten von HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, wurde untersucht, aber Fortschritte auf diesem Gebiet erfordern viel mehr Arbeit22,23,24,25,26. In diesem Beitrag wird eine optimierte Methode zur Transfektion von miRNAs und siRNAs in primäre menschliche Monozyten von HIV-infizierten Patienten und Kontrollen behandelt.
Dieses Protokoll stützt sich auf handelsübliche Reagenzien und Kits, da die Kontinuität des technischen Verfahrens dazu beiträgt, unnötige experimentelle Variablen bei der Arbeit mit klinischen Proben zu vermeiden. Nichtsdestotrotz gibt die Methode wichtige Tipps (d.h. die Anzahl der zellenbeschichteten oder kurzen Inkubation mit serumfreien Medien, um die Haftung der Zellen an der Platte zu fördern). Zusätzlich werden die in diesem Protokoll verwendeten Polarisationsbedingungen aus veröffentlichten Arbeitenabgeleitet 27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll zeigt die Verwendung von Primärzellen von HIV-infizierten Probanden als Modell für die Untersuchung von Monozyten und Makrophagen. HIV+ Patienten, die sich mit cART unterziehen, leben mehrere Jahre mit einer Infektion und können auch andere Co-Infektionen haben, die mit einem geschwächten Immunsystem zusammenhängen. Um die Immunmodulation in Gegenwart einer chronischen HIV-Infektion zu untersuchen, wurden Zellen direkt von Patienten geerntet. Da sich gezeigt hat, dass miRNAs ein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem HIV Clinical/Tumor Biorepository Core für die Bereitstellung von Patientenproben und dem Cellular Immunology Metabolism Core für die Bereitstellung von Durchflusszytometrieanalysen. Dieses Projekt wurde von NIH P20GM121288 und P30GM114732 finanziert.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
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