إنتاج مصل خالي من الهيباتوسفيرات البشرية ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية متعددة القوى
1MRC Centre for Regenerative Medicine,University of Edinburgh, 2UCL Great Ormond Street Institute of Child Health,University College London, 3Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health and Life Sciences,Brunel University London, 4School of Biochemistry and Immunology, Trinity Biomedical Sciences Institute,Trinity College Dublin
Summary
يصف هذا البروتوكول نهجاً لإنتاج الهيباتوسفيرات من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى باستخدام نظام ثقافة محدد وتجميع ذاتي للخلايا. هذا البروتوكول هو استنساخفي عدد من خطوط الخلايا، فعالة من حيث التكلفة ويسمح لإنتاج hepatospheres الإنسان مستقرة للتطبيق الطبي الحيوي.
Abstract
تطوير مصادر متجددة من أنسجة الكبد مطلوب لتحسين النمذجة القائمة على الخلايا، وتطوير الأنسجة البشرية للزرع. تمثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان مصادر واعدة لمجالات الكبد البشري. لقد طورنا طريقة مجانية ومحددة للمصل من التمايز الخلوي لتوليد مجالات الكبد البشري ثلاثي ة الأبعاد التي تشكلت من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى. ومن القيود المحتملة على هذه التكنولوجيا إنتاج المجالات الكثيفة مع المواد الميتة في الداخل. من أجل التحايل على هذا، قمنا بتوظيف تكنولوجيا ميكروويل أغاروز في كثافات الخلايا المحددة للسيطرة على حجم المجالات ثلاثية الجوانب، ومنع توليد النوى المبرمجة و / أو نخرية. وتجدر الإشارة إلى أن المجالات التي يولدها نهجنا تعرض وظيفة الكبد والنمط الظاهري المستقر، مما يمثل مورداً قيماً للبحث العلمي الأساسي والتطبيقي. ونحن نعتقد أن نهجنا يمكن أن تستخدم كتكنولوجيا منصة لتطوير المزيد من الأنسجة لنموذج وعلاج الأمراض البشرية، وفي المستقبل قد تسمح لتوليد الأنسجة البشرية مع بنية الأنسجة المعقدة.
Introduction
إن قدرة الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى على التجديد الذاتي، مع الاحتفاظ بالتعددية، توفر فرصة لإنتاج أنواع الخلايا البشرية والأنسجة عند الطلب. تم تمييز hPSCs بكفاءة في الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد (HLCs) باستخدام أنظمةالثقافة ذات الأبعاد الثنائية (2D) المحتسبة 1،2،3،4،5،6 ،7،8،9،10. وقد استخدمت هذه النظم لنموذج بنجاح مرض مونوجينيك، ودورة حياة الفيروس، وإصابة الكبد الناجمة عن المخدرات (ديلي)، والتعرض للجنين للسموم وأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية (NAFLD)11،12،13 ،14،15. ومع ذلك، هذه النماذج لا تملك بعض العيوب، والتي تحد من استخدامها الروتيني. وتشمل تلك التعبير علامة الجنين, النمط الظاهري غير مستقر وسوء بنية الأنسجة16,17,18,19, والتي يمكن أن تحد أيضا من الاستقراء لوظيفة الجهاز في الجسم الحي.
وللتغلب على هذه القيود، تم تطوير منصات تمايز ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لتقليدها في بنية الأنسجة الحية. وعلى الرغم من أن هذه النُهُج تمكينية، إلا أنها تعتمد على استخدام المنتجات والمصفوفات المشتقة من الحيوانات لدفع تكوين الأنسجة20و21و22، مما يحد من التوسع والتطبيق الواسع النطاق.
هنا، نقوم بتفصيل الإجراءات لتوليد كميات كبيرة من الهباتوسفيرات ثلاثية الجوانب من المراكز الصحية العالمية باستخدام مواد محددة وتجميع ذاتي للخلايا. وتجدر الإشارة إلى أن الأنسجة التي يولدها إجراءنا لا تزال تعمل لأكثر من سنة واحدة في ثقافة الخلايا وقادرة على دعم وظيفة الكبد في الجسم الحي23.
وباختصار، يسمح نهجالتمايز المحدد لدينا بتوليد الهبات والخلايا الجذعية البشرية المستقرة من كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية المتعددة القوى المستحثة. ونحن نعتقد أن الإجراء الموصوف يمثل اختراقا كبيرا في توليد الستراتوسفيرات الصددية ثلاثية الدضد للبحث العلمي الأساسي والتطبيقي.
Protocol
1. إعداد قوالب الصفيحة الدقيقة أغاروز ملاحظة: يجب أن تكون وسائل الإعلام المستخدمة في هذه التجارب معقمة وفي درجة حرارة الغرفة (RT) لثقافة الخلايا. إعداد قوالب أجاروز 2٪. إذابة 2 غرام من درجة حرارة ذوبان منخفضة أجاروز في 100 مل من الماء المقطر المعقمة. سخني بعناية في الميكروويف مع اهتزاز الفاصل الزمني لتذوب تماما. أضف 520 ميكرو لتر من الأجروز المذاب إلى قالب تنسيق 256 بئرًا واترك هاليًا لتماسكه. نقل كل لوحة ميكروروز أغاروز في بئر واحد من لوحة 12 جيدا. إضافة 1.5 مل من 1X دولبكو الفوسفات المخزنة المالحة (DPBS) مع كاليفورنيا2 +/ ملغ2 + إلى كل بئر وإزالة فقاعات الهواء من microwells عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات باستخدام طرف ماصة P1000. ويتم ذلك لضمان بذر الخلايا موحدة.ملاحظة: يمكن تخزين لوحات أغاروز الدقيقة لمدة تصل إلى 6 أشهر عند درجة حرارة 4 درجة مئوية في 1x DPBS. 2. بذر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في لوحات ميكروويل أغاروز إعداد تعليق الخلية يستنشق الوسيلة من ثقافة غير متمايزة من hPSCs كما سبق وصفها8.ملاحظة: يتم زراعة hPSCs على LN-521 في mTeSR1 مع المتوسط تغيير كل 24 ساعة، وتمر بانتظام بمجرد أن تصل الخلايا 75٪ إلى 85٪ من الملاءمة كما هو موضح سابقا8. شطف الخلايا مع 5 مل من RT 1X DPBS دون كاليفورنيا2 +/ ملغ2 + وإزالة المخزن المؤقت. إضافة 5 مل من 1X الكاشفتفكك الخلية (جدول المواد) إلى الخلايا والسماح تفكك الخلايا عن طريق حضانة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 6-8 دقائق.ملاحظة: لوقف رد الفعل، فحص انفصال الخلية تحت المجهر. يجب فصل الخلايا جزئيًا عن اللوحة. تمديد الحضانة لمدة 1-2 دقيقة إضافية إذا كان هناك حاجة إلى وقت أطول. وقف رد الفعل عن طريق إزالة كاشف انفصال الخلية وإضافة 5 مل من mTeSR1 الطازجة المتوسطة تستكمل مع 10 μM رو المرتبطة كيناز (ROCK) المانع Y27632 إلى الخلايا. فصل الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات باستخدام طرف ماصة P1000. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الهيموكيتوميومتر واستبعاد تلطيخ الأزرق trypan. بعد ذلك، إعداد تعليق الخلية في التركيز المطلوب. حساب العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة. للتمايز 3D hepatosphere، البذور 3.84 × 105 خلايا لكل ميكروبلات أغاروز لتوليد spheroids مع 100-150 ميكرومتر في القطر. نقل العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي معقمة 15 مل أو 50 مل والطرد المركزي أنبوب في 200 × ز لمدة 5 دقائق في RT لبيليه الخلايا. يستنشق وتخلص من الخلايا الفائقة وإعادة تعليق الخلايا في mTeSR1 المتوسطة بالإضافة إلى 10 μM ROCK المانع Y27632. تمييع بيليه الخلية في الحجم المناسب من المتوسطة إلى التركيز النهائي من 2.1 × 106 خلايا / مل. بذر الخلايا إلى الألواح الدقيقة أغاروز المعدةملاحظة: إذا كنت تستخدم الألواح الدقيقة أغاروز المخزنة في الثلاجة، ضعها في حاضنة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل الاستخدام وأسق DPBS 1x من البئر قبل بذر الخلايا. إضافة 190 درجة مئوية من تعليق الخلية في ميكروويل أغاروز. بعد البذر، والعودة لوحات إلى حاضنة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 2 ساعة للسماح للخلايا لتسوية. بعد 2 ح، إضافة 1 مل من mTeSR1 الطازجة والدافئة المتوسطة تستكمل مع 10 *م مثبطات روك Y27632 إلى كل بئر. إعادة لوحات إلى حاضنة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة وفحص تشكيل المجالات في اليوم التالي للسماح للخلايا لإرفاق. 3. التمييز بين hPSCs إلى الهيباتوسفيرات ثلاثية البعد على Microwells أغاروز إعداد الآبار المغلفة بولي 2-هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات (بولي هيما) حل 2 غرام من البولي هيما في 100 مل من الإيثانول 95٪. يُحرّك الحل بين عشية وضحاها باستخدام طبق ساخن عند درجة حرارة 55 درجة مئوية. أضف 250 ميكرو لتر من محلول البولي هيما لكل بئر من طبق 24 بئرًا ويجف بين عشية وضحاها عند 60 درجة مئوية باستخدام الفرن. تحضير من التمايز وسط إعداد حل مخزون 1000x من النشاط البشري A عن طريق حل النشاط البشري بروتين اللوفيلي في الزلال المصل البقري العقيم 0.2٪ (BSA)/DPBS إلى تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام/مل. يُحفظ عند -20 درجة مئوية في العليكوتات الصغيرة. استخدمه في 1:1,000. إعداد حل مخزون 1000x من Wnt3a عن طريق حل الماوس Wnt3a البروتين الليوفيفي في معقمة 0.2٪ BSA / DPBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل. يُحفظ عند -20 درجة مئوية في العليكوتات الصغيرة. استخدمه في الساعة 1:200 إعداد حل مخزون 1000x من عامل نمو خلايا الكبد البشرية (HGF) عن طريق حل البروتين اللافيلي HGF البشري في معقمة 0.2٪ BSA / DPBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل. يُحفظ عند -20 درجة مئوية في العليكوتات الصغيرة. استخدمه في 1:1,000. إعداد حل مخزون 1000x من oncostatin M (OSM) عن طريق حل OSM في معقمة 0.2٪ BSA / DPBS إلى تركيز نهائي من 20 ميكروغرام / مل. يُحفظ عند -20 درجة مئوية في العليكوتات الصغيرة. استخدمه في 1:1,000. إعداد حل مخزون 1000x من عامل النمو الظهاري (EGF) عن طريق حل البروتين الليوفيفي في معقمة 0.2٪ BSA / DPBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل. يُحفظ عند -20 درجة مئوية في العليكوتات الصغيرة. استخدمه في 1:1,000. إعداد حل مخزون 1000x من عامل النمو الليفي الأساسي (bFGF) عن طريق حل البروتين الليفيلي في معقمة 0.2٪ BSA / DPBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل. يُحفظ عند -20 درجة مئوية في العليكوتات الصغيرة. استخدمه في 1:1,000. إعداد حل مخزون 1000x من عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) عن طريق حل البروتين الليفيلي في 0.2٪ BSA / DPBS إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل. يُحفظ عند -20 درجة مئوية في العليكوتات الصغيرة. استخدمه في 1:1,000. جعل التمايز endoderm المتوسطة تتكون من معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI 1640) المتوسطة القاعدية تستكمل مع 2٪ B27 الملحق (50X، دون الأنسولين)، و 1٪ البنسلين / العقديات (تركيزات النهائي: 100 وحدة IU / مل و 100 ميكروغرام / مل، على التوالي). ما لم يُشار إلى ذلك، في كل تغيير متوسط، تكمل ة الحجم المطلوب بـ Wnt3a وactivin A بتركيز نهائي قدره 50 نانوغرام/مل و100 نانوغرام/مل، على التوالي.ملاحظة: يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ويُستعمل في غضون أسبوعين. جعل التمايز hepatoblast المتوسطة تتكون من خروج المغلوب Dulbecco تعديل النسر المتوسطة (KO-DMEM) مع 20٪ استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR) وتستكمل مع 0.5٪ من تكملة بديلة لL-الجلوتامين، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 0.1 مليون متر بيتا ميركابتوإيثانول، 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، و 1٪ البنسلين / العقديات (التركيزات النهائية في 100 وحدة IU / مل و 100 ميكروغرام / مل، على التوالي). تصفية تحت فراغ.ملاحظة: يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ويُستعمل في غضون أسبوعين. جعل مرحلة نضج خلايا الكبد المتوسطة تتكون من المتوسطة الكبد مع 1٪ من تكملة بديلة لL-الجلوتامين، 10 ميكروديزون هيدروكورتيزون 21-هيميسوستينات ملح الصوديوم (HCC)، 1٪ البنسلين / العقدية (تركيزات النهائي في 100 وحدة دولية / مل و 100 ميكروغرام/مل، على التوالي). لكل تغيير متوسط، تكمل ة الحجم المطلوب مع OSM وHGF (التركيزات النهائية في 20 نانوغرام/مل و 10 نانوغرام/مل، على التوالي).ملاحظة: تخزين المخزون في 4 درجة مئوية واستخدامها في غضون أسبوعين. جعل وسيطصيانة خلايا الكبد تتكون من متوسط E وليام تكملها 10٪ استبدال المصل بالضربة القاضية، وتتكون من 1٪ من تكملة بديلة لL-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / العقديات (تركيزات النهائي في 100 وحدة دولية / مل و 100 ميكروغرام / مل، على التوالي). لكل تغيير متوسط، تكملة الحجم المطلوب مع HGF، EGF، bFGF وVEGF (التركيز النهائي لكل عامل نمو في 10 نانوغرام / مل).ملاحظة: تخزين المخزون في 4 درجة مئوية واستخدامها في غضون أسبوعين. تحقق من تشكيل الكبد 24 ح آخر البذر والشروع في التمايز الكبد. إزالة بعناية mTeSR1 المتوسطة واستبدالها ب1 مل من التمايز endoderm الطازجة المتوسطة تستكمل مع 100 نانوغرام / مل أكتيفين A و 50 نانوغرام / مل Wnt3a. تغيير تكملة endoderm فتيلة المتوسطة كل 24 ساعة لمدة 3 أيام لhESCs. عند العمل مع hiPSCs، تمديد هذه المرحلة لمدة 2 أيام أخرى تكمل وسائل الإعلام مع activin A (100ng/mL) وحدها. بعد الحث endoderm النهائي، والتحول إلى التمايز hepatoblast المتوسطة لمواصفات هيباتوبلاست لمدة 5 أيام استبدال المتوسطة كل 2 أيام وإجراء التغيير الأخير في اليوم الأخير من مواصفات hepatoblast. نقل hepatospheres في الآبار المغلفة بولي هيما. غسل الخلايا مرة واحدة مع الكبد النضج المتوسطة دون ملاحق بعد إزالة KSR / DMSO المتوسطة وإضافة 1 مل من نضج الكبد المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل HGF و 20 نانوغرام / مل OSM. باستخدام ماصة P1000، رفع hepatospheres من ميكروبلايت أغاروز عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا الحل عدة مرات. نقل المتوسطة التي تحتوي على hepatospheres إلى بئر المغلفة بولي HEMA. غسل ميكروبليت أغاروز باستخدام 1 مل من نضج الكبد المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل HGF و 20 نانوغرام / مل OSM ونقل المتوسطة إلى البولي HEMA المغلفة جيدا. كرر الخطوة 3.6.4 أكبر عدد ممكن من المرات من أجل نقل جميع الهيباتوسفيرات من لوحة أغاروز الدقيقة.ملاحظة: من الأهمية بمكان أن الماصة بعناية صعودا وهبوطا الحل الذي يحتوي على الغلاف الجوي لتجنب الإضرار بها. يستنشق بعناية المتوسطة الزائدة دون إزالة hepatospheres باستخدام ماصة P100 حتى ~ 1 مل من المتوسطة التي تحتوي على hepatospheres لا يزال في بئر المغلفة بولي HEMA. تغيير المتوسط كل 48 ساعة لمدة 12 يوما. في اليوم 20 عند العمل مع hESCs أو اليوم 22 إذا كان العمل مع hiPSCs، تبديل المتوسطة إلى وسيط صيانة خلايا الكبد. إزالة النضج الكبد المتوسطة وغسل الخلايا مرة واحدة مع وسيط صيانة الكبد دون المكملات الغذائية. إضافة 1 مل من صيانة خلايا الكبد المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل من HGF، EGF، FGF وVEGF. تغيير المتوسطة لصيانة خلايا الكبد الطازجة المتوسطة كل 48 ساعة. 4- التحليل الوظيفي للغلافات الـ 3D المستزرعة الطويلة الأجل التحول إلى نضج الكبد المتوسطة تستكمل مع 10 μM HCC، L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / العقديات (التركيزات النهائية في 100 وحدة IU / مل و 100 ميكروغرام / مل، على التوالي) و 10 نانوغرام / مل HGF 48 ساعة قبل إجراء التحليل الوظيفي. تحليل وظيفة التمثيل الغذائي للخلايا الكبدباستخدام السيتوكروم (CYP) P450 الاختبارات. استبدال المتوسط بـ 1 مل من النضج الطازج للخلايا الكبدية المتوسطة المكمّلة بالركيزة 50 ميكرومتر لوسيفيرين-6′-خماسي فلورو-بنزيل الأثير (لوسيفيرين-PFBE) للكشف عن النشاط القاعدي CYP3A أو 100 μM luciferin-methyl ether (luciferin-ME) الركيزة للكشف عن الركيزة CYP1A2 النشاط القاعدي (عدد النسخ المتماثل = 3). استخدام وسائط زراعة الأنسجة كتحكم سلبي.ملاحظة: من أجل تجنب التفاعل المتبادل، فمن المستحسن عدم استخدام نفس الآبار التي تحتوي على hepatospheres 3D لاختبار مختلف الأنشطة CYP P450 ولكن لأداء لهم في الآبار الفردية. حضانة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. جمع supernatants باستخدام طرف ماصة P100 وإجراء فحص وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قياس المستويات النسبية للنشاط القاعدي ة وتطبيع لكل بروتين ملغ كما يحددها اختبار حمض bicinchoninic (BCA). اختبار إنتاج بروتين المصل باستخدام اختبار المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA). استبدال المتوسطة مع 1 مل من نضج خلايا الكبد الطازجة المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل HGF و 20 نانوغرام / مل OSM (عدد النسخ المتماثل = 3). استخدام وسائط زراعة الأنسجة كتحكم سلبي. حضانة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. جمع supernatant باستخدام طرف ماصة P100 وقياس المستويات النسبية لإنتاج بروتين المصل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تطبيع لكل بروتين ملغ كما يحددها تحليل BCA. 5- الكيمياء المناعية إعداد مقاطع البارافين التي تحتوي على الغلاف الجوي. غسل hepatospheres ثلاث مرات مع 1X DPBS. إصلاح hepatospheres مع الميثانول الجليد الباردة لمدة 30 دقيقة. غسل ثلاث مرات مع 1X DPBS. تضمين hepatospheres في 300 درجة مئوية من محلول خفف من 2٪ أجاروز حل في H2O باستخدام بئر فارغة من لوحة 24 جيدا كقالب وتركها لتوطد لمدة 30 دقيقة. تضمين أغاروز التي تحتوي على hepatospheres في البارافين. قسم كتلة البارافين التي تحتوي على hepatospheres ثابتة في 4 أقسام سميكة ميكروتومي. إزالة الصبح والإماهة من الأقسام.ملاحظة: استخدام حلول جديدة كلما كان ذلك ممكناً. لا تستخدم الحلول التي كانت على الحوض الصغير تلطيخ لأكثر من أسبوع. ضع المقاطع في حامل شرائح. تزج رف الشريحة التي تحتوي على أقسام في حوض تلطيخ تحتوي على 300 مل من الزيلين لمدة 5 دقائق. كرر الخطوة 5.2.2. تزج في الإيثانول المطلق لمدة 20 s. تزج في الإيثانول 95٪ لمدة 20 s. تزج في الإيثانول 90٪ لمدة 20 s. تزج في الإيثانول 80٪ لمدة 20 s. تزج في الإيثانول 70٪ لمدة 20 s. إعادة ترطيب المقاطع بالماء لمدة 5 دقائق.ملاحظة: الحفاظ على الشرائح في نفس رف الشرائح ونقله من حوض واحد تلطيخ إلى واحد المقبل. حجم المستخدمة (عموما ~ 300 مل) يعتمد على حجم الحوض الصغير تلطيخ. مستضد استرجاع أقسام البارافين التي تحتوي على الغلاف الجوي. قم بإزالة الشمع وإزالة الترطيب في محلول احتياطي مؤقت لدرجة الحموضة 9.0 لمدة 15 دقيقة في الميكروويف عند 800 واط. تبريد العينات عن طريق غمر لهم في مياه الصنبور لمدة 5 دقائق. تلطيخ المناعة. احتضان الشرائح مع حل حظر مصنوعة من PBS مع 0.1٪ بوليسوربات 20 (PBS / T) / 10٪ BSA لمدة ساعة واحدة في RT. استبدال حل حظر مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة المخففة في PBS / T / 1٪ BSA وحضانة في 4 درجة مئوية مع التحريض لطيف بين عشية وضحاها. غسل الخلايا مع PBS / T لمدة 5 دقائق وكرر ثلاث مرات. حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخففة في PBS / T / 1٪ BSA وحضانة في الظلام في RT لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف.ملاحظة: يتم سرد الأجسام المضادة الأولية والثانوية الأمثل في جدول المواد. غسل الخلايا مع PBS / T لمدة 5 دقائق وكرر ثلاث مرات. إضافة 4 ‘، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) إلى الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ووضع غطاء زجاجي بلطف للحد من فقاعات الهواء. احتفظ بالخلايا الثابتة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام. مراقبة تلطيخ تحت المجهر مع مرشح المناسبة ومصباح الفلورسنت.ملاحظة:تخزين لوحات في 4 درجة مئوية في الظلام حتى التصوير.
Representative Results
تم تمييز المجاميع ثلاثية الأبعاد من خط الخلايا الجذعية الجنينية (H9) أو خط الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحث (P106) نحو سلالة الخلايا الكبدية باستخدام الإجراء المحدد (الشكل1). كانت الخلايا الجذعية متعددة القوى تستعد لأول مرة نحو بطانة الجلد النهائي قبل مواصفات hepatoblast. بعد ذلك، نضجت الخلايا الهيباتولاتية في المجالات الهيباتوبلاس 3D التي يمكن الحفاظ عليها في الثقافة لمدة تصل إلى سنة واحدة23. لدراسة بنية المجالات ثلاثية الجوانب، تم إصلاح 30 من المجالات المشتقة من hESC أو iPSC القديمة أو iPSC للكشف عن وجود البروتينات المعبر عنها في خلايا الكبد والخلايا mesenchymal. تم استخدام العامل النووي للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α) وvimentin علامة mesenchymal، وكشف عن وجود طبقة خارجية تتكون من خلايا الكبد مثل الخلايا المحيطة بجوهر الخلايا mesenchymal (الشكل 2). تابعنا هذه التجارب تحليل التعبير عن البروتينات المعبر عنها في خلايا الكبد: الزلال، CYP3A وE-الكادرين. وكشفت التلطيخ المناعي أن التعبير عن هذه البروتينات كان مقصورا على الطبقة الخارجية من المجالات (الشكل3). وأجريت تحليلات وظيفية لغلاف اتّهاب في اليوم الثلاثين من الثقافات. CYP1A2 و CYP3A هي إنزيمات هامة داخل خلايا الكبد الوظيفية. وتم تقييم نشاطهم باستخدام الاختبارات الراسخة. أظهرت الهيباتوسفيرات المشتقة من H9 نشاط CYP3A من 220,375 ± 74514 RLU/mL/mg البروتين وCYP1A2 النشاط من 732,440 ± 33,330 RLU/mL/mg البروتين (الشكل4A). كان نشاط CYP3A في المجالات الهيباتوسفيرات المشتقة من P106 132117 ± 43,391 RLU/mL/mg البروتين وكان نشاط CYP1A2 409,907 ± 121,723 RLU/mL/mg بروتين (الشكل4B). بالمقارنة مع دفعتين من خلايا الكبد الأولية البشرية، عرضت مجالات الكبد 3D مستويات محترمة من نشاط CYP10. كشف تحليل تخليق وإفراز الزلال وبروتين ألفا فيتوبروتين (أ ف ب) أن الهيباتوسفيرات المشتقة من H9 تفرز 683.9 ± 84 و 159 ± 20 نانوغرام/مل/24 ساعة/ملغ بروتين الزلال وبروتين ألفا فيتوبروتين، على التوالي (الشكل5ألف). في حين أن P106 المستمدة من hepatospheres تفرز 497 ± 41 و 756 ± 24 نانوغرام / مل / 24 ساعة / ملغ بروتين الزلال وألفا فيتوبروتين، على التوالي (الشكل5ب). الشكل 1 إجراء التمايز التدريجي لتوليد الهبات واللون ثلاثي الدناطمنات من الـ hESCs. وتمثل الأقواس الزرقاء أياماً تمايزاً بالنسبة للمراكز الزمنية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2 إعادة التنظيم الهيكلي لمجالات الهيباتوسفيرات ثلاثية الدّالة. صور تمثيلية للتعبير عن العامل النووي للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α – الأخضر) وفيمنتين (الأحمر) في (A) H9 المستمدة من هيباتوسفيرات و (B) P106 المستمدة من hepatospheres 3D وما يقابلها من الغلوبولين G (IgG) الضوابط . قضبان مقياس تمثل 60 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3 تقييم تعبير علامة الكبد في الغلاف الكبدي ثلاثي الدّالة. صور تمثيلية للتعبير عن علامات خلايا الكبد – الزلال، CYP3A، E-الكادرين والضوابط IgG المقابلة لها في (A) H9 – و (B) P106 المستمدة من hepatospheres 3D. قضبان مقياس = 60 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4 Cytochrome P450 وظيفة في الغلاف الجوي 3D. قياس نشاط السيتوكروم P450 1A2 و 3A في (A) H9 المستمدة من hepatospheres 3D و (B) P106 المستمدة من hepatospheres 3D. تمثل البيانات متوسط ثلاثة عمليات تكرار بيولوجية، وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD). يُقتبس النشاط على أنه وحدات الضوء النسبي (RLU) لكل مل لكل ملغ من البروتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5 تحليل إفراز بروتين الهيباتوسفير. تم تحليل إفراز الزلال وألفا فيتوبروتين (أ ف ب) في (A) المستمدة من H9 3D hepatospheres و (B) P106 المستمدة من hepatospheres 3D. البيانات هي ممثلة لثلاثة تكرارات بيولوجية، وقضبان الخطأ تمثل SD. يتم اقتباس البروتين السري كنانوغرام من البروتين لكل مل لكل 24 ساعة لكل ملغ من البروتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
مطلوب تطوير أنظمة محددة وخالية من xeno لإنتاج hepatospheres البشرية في 3D على حد سواء في المختبر وفي المساعي الحية. في الوقت الحاضر يتم تنفيذ معظم نهج التمايز الكبدي من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في ثقافتين ملتصقتين بالأبعاد. هذه البيئات تفتقر إلى العديد من العظة البيئية التي تنطوي عليها تكوين الأنسجة والتوازن التي تشمل; تفاعلات الخلايا غير المتجانسة، وإنتاج المصفوفة وإعادة تشكيلها، مما أدى إلى ضعف الترجمة إلى في بيولوجيا الجسم الحي18،19.
ونتيجة لذلك، ركزت البحوث على نُهج بديلة لتوليد المجالات الهيبطية من الخلايا الجذعية المتعددة القوى. وقد تقدم عدد من الدراسات ثلاثية الجوانب في هذا المجال، ولكن تلك تعتمد على المنتجات الحيوانية20،22،24 لتقديم الدعم و / أو تتطلب استخدام الأنسجة البشرية21،22 مما يعقد توسيع نطاق التكنولوجيا والتنازلات التجريبية استنساخ وتطبيق.
يتم تعريف الإجراء الموضحفي مقالنا (الشكل 1) ، وكفاءة ، واستنساخ عالية وفعالية من حيث التكلفة ، مما يسمح لإنتاج مجالات الكبد الوظيفية ، والتي لا تزال تعمل على مدى عام في المختبر وتوفير دعم الكبد الحرجة في [ ترجمبوونز 14] الأهم من ذلك، هذه المنصة تسمح للمستخدم للسيطرة على حجم مجالات الكبد 3D، والحد من تشكيل مراكز نخرية كثيفة وفقدان النمط الظاهري.
ويمثل نقل الألواح الهيباتوسفيرات ثلاثية الدناطي إلى الصفائح المغلفة متعددة الهيما خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. من المهم أن الماصة بلطف في هذه المرحلة في الإجراء لتجنب الإضرار بالكرة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء تغييرات وسائل الإعلام بعناية لتجنب الإجهاد القص وتشويه هيكل المجال.
في هذه الدراسات، عرضت hepatospheres 3D بنية منظمة (الشكل 2 والشكل 3)، وظائف السيتوكروم P450 (الشكل 4)وبروتينات الكبد التسرّفة، بما في ذلك الزلال وألفا فيتوبروتين (الشكل5). وقد تم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح في أربعة خطوط الخلايا الجذعية متعددة القوى مع نتائج مماثلة. وبالنظر إلى المستقبل، يمكن استخدام هذه التكنولوجيا كمنصة لتطوير المزيد من الأنسجة البطانية وmesenchymal مع البنى المعقدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بجوائز من منصة الطب التجديدي في المملكة المتحدة (MRC MR/L022974/1) ومكتب كبير العلماء (TCS/16/37).
Materials
| Cell Culture and functional assays | |||
| Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Equipment | |||
| Microwave | Bosch | ||
| Microtome | Leika | RM2125RT | |
| Oven | Thermoscientific | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
| IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
| Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |
References
- Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).
- Hannan, N. R., Segeritz, C. -. P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
- Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).
- Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9 (1), (2014).
- Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
- Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
Cite This Article
Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O’Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).