Kırılgan X Mental Retardasyon-1 Genininde Sitozin-guanin-guanin Trinükleotid Tekrarlarının Ölçülmesi için Sağlam Polimeraz Zincir Reaksiyonu Esaslı Bir Test
Summary
Fragile X mental retardasyon-1 genindeki sitozin-guanin-guanin trinükleotid tekrarlarının ölçülmesi için doğru ve sağlam polimeraz zincir reaksiyonu esaslı bir test, Kırılgan X sendromu ve Fragile X ile ilişkili moleküler tanı ve taramayı kolaylaştırır daha kısa dönüş süresi ve ekipman yatırımı ile bozukluklar.
Abstract
Kırılgan X sendromu (FXS) ve ilişkili bozukluklar, Fragile X mental retardation-1(FMR1)gen organizatörünün 5′ çevrilmemiş bölgesinde (UTR) sitozin-guanin-guanin (CGG) trinükleotid tekrarının genişlemesinden kaynaklanır. Geleneksel olarak, genetik bir analizör üzerinde kapiller elektroforez parça analizi FMR1CGG tekrarları boyutlandırma için kullanılır , ancak tekrar sayısı 200 daha yüksek olduğunda tam ölçüm için ek Güney leke analizi gereklidir. Burada, FMR1CGG tekrarlarının sayısallaştırılması için doğru ve sağlam polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı bir yöntem salıyoruz. Bu testin ilk adımı, Kırılgan X PCR kiti kullanılarak FMR1 organizatörü5’UTR’deki tekrar dizilerinin PCR amplifikasyonudur, ardından PCR ürünlerinin saflaştırılması ve mikroakışkan kapiller elektroforez aletinde parça boyutlandırması ve analiz yazılımı kullanarak bilinen tekrarlar ile standartlaratıfta bulunarak CGG tekrarları sayısının sonraki yorumu. Bu PCR tabanlı test tekrarlanabilir ve 200’den fazla (tam mutasyon olarak sınıflandırılır), 55-200 (premutasyon olarak sınıflandırılır), 46-54 (orta) ve 10’dan fazla tekrar numarası na sahip olanlar da dahil olmak üzere FMR1 organizatörlerinin CGG tekrarlarının tüm yelpazesini tanımlayabilme yeteneğine sahiptir ve 10 45 (normal). FXS ve Fragile X ile ilişkili bozuklukların sağlamlık ve hızlı raporlama süresi ile sınıflandırılmasını kolaylaştıran uygun maliyetli bir yöntemdir.
Introduction
Kırılgan X sendromu (FXS) ve Kırılgan X ilişkili bozukluklar, örneğin, titreme ve ataksi sendromu (FX-TAS) ve primer yumurtalık yetmezliği (FX-POI) esas olarak 5′ çevrilmemiş trinükleotid tekrar genişleme sitozin-guanin-guanin (CGG) neden olur Xq27.31,2’deKırılgan X mental retardasyon-1(FMR1)geninin bölge (UTR) FMR1 kodlanmış protein (FMRP), mRNA veya modüle sentezin inkbiyotasyon, stabilite ve dendritik taşınmasını düzenleyerek nöronal gelişim ve sinaptik plastisitede işlev veren poliribozom ile ilişkili RNA-bağlayıcı bir proteindir. kısmi postsinaptik proteinlerin3,4,5,6,7.
>200 CGG tekrar boyutu ile dinamik varyasyon tam mutasyon olarak tanımlanır, hangi anormal hipermetilasyon ve FMR1 organizatörü sonraki transkripsiyonel susturma neden olur8. Ortaya çıkan fmrp protein yokluğu veya eksikliği normal nöronal gelişimi bozar veFXSneden 9 , çeşitli klinik belirtiler ile karakterize, şiddetli zihinsel özürlülük orta dahil olmak üzere, gelişimsel gecikme, hiperaktif davranışlar, kötü temas ve otistik belirtileri10,11,12. Kadın FXS hastalarında sunum genellikle erkeklerde olduğundan daha hafiftir. 55-200 ve 45-54 arasında değişen CGG tekrar boyutu sırasıyla premutasyon ve ara durum olarak sınıflandırılır. İstikrarsızlık yüksek derecede nedeniyle, bir premutasyon veya ara alel CGG tekrar boyutu muhtemelenyavru13,14iletildiğinde genişletir . Bu nedenle, premutasyon alelleri olan taşıyıcılar tekrar genişleme nedeniyle FXS etkilenen çocuk sahibi olma riski yüksektir, ve bazı durumlarda, ara aleller iki nesil boyunca tam mutasyon aralığına tekrar boyutunu genişletebilirsiniz15, 16. yıl. Ayrıca, premutasyon ile erkekler de geç başlangıçlı FX-TAS17,18,19gelişme riski iletmek, premutasyon kadın hem FX-TAS ve FX-POI için yatkın iken20, 21,22. Son zamanlarda, bu gelişimsel gecikme ve sosyal davranışlarda sorunlar ile otistik spektrum bozuklukları premutasyon FMR1 alelleri23olan çocuklarda sunulmaktadır bildirilmiştir,24.
Tam CGG tekrar boyutunu belirlemek için sınıflandırma ve FXS ve Kırılgan X ilişkili bozuklukların tahmini için büyük öneme sahiptir25,26. Tarihsel olarak, CGG tekrar bölgeye özgü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) parça boyutlandırma artı Güney leke analizi ile FMR1 CGG tekrar27moleküler profilleme için altın standart olmuştur. Ancak, geleneksel spesifik PCR 100-130’dan fazla tekrarile büyük premütasyonlara karşı daha az duyarlıdır ve tam mutasyonları yükseltmekten acizdir27,28. Ayrıca, tekrar boyutlandırma için geleneksel bir genetik analizör üzerinde kılcal elektroforez fazla 200 CGG tekrarları ile FMR1 PCR ürünleri tespit etmek için başarısız olur. Güney leke analizi, normalden tam mutasyon tekrar sayılarına kadar daha geniş bir tekrar boyutu aralığının farklılaşmasını sağlar ve tam mutasyonu doğrulamak için (erkeklerde) ve heterozigot alelleri tam mutasyonile ayırt etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. normal tekrar boyutları ile görünüşte homozigot aleller (kadınlarda). Ancak, yinelemeleri ölçmek için çözünürlük sınırlıdır. Daha da önemlisi, bu adım adım test stratejisi emek yoğun, zaman alıcı ve maliyet-etkisiz.
Burada, FMR1CGG tekrarları nicelleştirme için doğru ve sağlam PCR tabanlı bir yöntem salıyoruz. Bu testin ilk adımı, Fragile X PCR kitini kullanarak FMR1 organizatörün 5’UTR’deki tekrar dizilerinin PCR yükseltilmesidir. PCR ürünleri saflaştırılır ve parça boyutlandırma bir mikroakışkan kapiller elektroforez aleti üzerinde gerçekleştirilir ve analiz yazılımı kullanılarak CGG tekrarlarının sayısının daha sonra yorumlanması, PCR parça uzunluğunun CGG tekrarlarının sayısıyla doğru orantılı olduğu gerekçesi. PCR sistemi, gc açısından zengin trinükleotid tekrar bölgesinin amplifikasyonunu kolaylaştıran reaktifler içerir. Bu PCR tabanlı test tekrarlanabilir ve FMR1 organizatörleri CGG tekrarları tüm aralıkları tespit yeteneğine sahiptir. Bu daha az dönüş süresi ve ekipman yatırım ile FXS ve Kırılgan X ile ilgili bozuklukların moleküler tanı ve tarama geniş uygulama bulabilirsiniz ve böylece, klinik daha geniş bir yelpazede kullanılabilir maliyet-etkin bir yöntemdir Laboratuvar.
Protocol
Representative Results
Discussion
FXS trizomi sonra entelektüel bozukluğun ikinci en sık nedenidir 21, X bağlı zeka geriliği yaklaşık yarısı için muhasebe30, yaklaşık 1 etkileyebilir 4,000 erkek ve 1 8.000 kadın. Daha da önemlisi, yaklaşık 1 250-1.000 kadın bir premutasyon taşımak, ve bu frekans 1 250-1.600 erkeklerde26,31,32,33. CGG’nin premutasyon alelleri yavrulara iletildiğinde t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma NSFC Acil Durum Yönetimi Projesi (Hibe No. 81741004), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81860272), Guangxi İl Bilim ve Teknoloji Vakfı Ana Araştırma Planı hibe tarafından desteklenmiştir ( Hibe No AB16380219), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Hibe (Grant No. 2018M630993) ve Guangxi Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 2018GXNSFAA281067).
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
| FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
| FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
| NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Paper towels | |||
| PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
| reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
| S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
| TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |
References
- Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
- Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
- Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
- Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
- Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
- Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
- Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
- Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
- Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
- Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
- Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
- Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
- Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
- Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
- Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
- Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
- Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
- Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
- Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d’endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
- Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
- Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
- Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
- Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
- Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
- Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
- Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
- Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
- Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
- Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene–and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
- Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
- Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
- Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
- Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
- Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
- Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
- Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
- Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).
