Робуст Полимераза Цепная реакция на основе Ассаем для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяет в хрупкой X умственной отсталости-1 Гена
Summary
Точный и надежный полимеразы цепной реакции на основе анализ для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяется в хрупкий X умственной отсталости-1 ген облегчает молекулярную диагностику и скрининг хрупкий X синдром и хрупкие X-связанных расстройства с более коротким временем оборота и инвестициями в оборудование.
Abstract
Хрупкий X синдром (FXS) и связанные с ним расстройства вызваны расширением цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить в 5′ непереведенных региона (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1 (FMR1) гена промоутер. Условно, анализ фрагмента капиллярного электрофореза на генетическом анализе используется для калибровки CGG повторяет FMR1, но дополнительный анализ южной поточности требуется для точного измерения, когда число повторений выше 200. Здесь мы представляем точный и надежный полимеразной цепной реакции (PCR) на основе метода количественной оценки CGG повторяет FMR1. Первым шагом этого теста является пЧР усиление повторяющихся последовательностей в 5’UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект, а затем очистка продуктов ПЦР и размер фрагментов на микрофлюидных капиллярных электрофореза инструмент, и последующее толкование числа cGG повторяется по ссылкам стандартов с известными повторами с использованием программного обеспечения анализа. Этот анализ на основе ПЦР воспроизводим и способен определить весь спектр CGG повторов промоутеров FMR1, в том числе с повторным числом более 200 (классифицируется как полная мутация), от 55 до 200 (премутация), от 46 до 54 (промежуточные), и от 10 до 45 (нормально). Это экономически эффективный метод, который облегчает классификацию FXS и хрупких X-связанных расстройств с надежностью и быстрым временем отчетности.
Introduction
Хрупкий X синдром (FXS) и Хрупкие X связанных расстройств, например, тремор и синдром атаксии (FX-TAS), и первичной недостаточности яичников (FX-POI) в основном вызваны цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить расширение в 5 ‘непереведенных области (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1(FMR1) гена на Xq27.31,2. FMR1 закодированный белок (FMRP) является полирибоом связанных РНК-связывающий белок, который функционирует в развитии нейронов и синаптической пластичности путем регулирования альтернативного сплайсинга, стабильности и дендритной транспортировки мРНК или модулирующий синтез частичных постсинаптических белков3,4,5,6,7.
Динамический вариант с CGG повторить размер йgt;200 описывается как полная мутация, которая вызывает аномальные гиперметилирования и последующего транскрипционного глушить FMR1 промоутер8. В результате отсутствие или отсутствие белка FMRP нарушает нормальное развитие нейронов и вызывает FXS9, характеризуется различными клиническими симптомами, в том числе умеренной до тяжелой умственной неполноценности, задержки развития, гиперактивного поведения, плохие контакты и аутичные проявления10,11,12. Презентация у женщин FXS пациентов, как правило, мягче, чем у мужчин. Размер повтора CGG в диапазоне от 55 до 200 и 45 до 54 классифицируются как премутационный и промежуточный статус, соответственно. Из-за высокой степени нестабильности, CGG повторить размер в премутации или промежуточный аллель предположительно расширяется при передаче от родителей к потомству13,14. Таким образом, носители с аллелями премутации подвергаются высокому риску иметь детей, пострадавших от FXS из-за повторного расширения, а в некоторых случаях, промежуточные аллели могут расширить их размер повторения до полного диапазона мутации в течение двух поколений15, 16. Кроме того, мужчины с премутацией также передать повышенный риск развития позднего начала FX-TAS17,18,19, в то время как премутации женщины предрасположены как fx-TAS и FX-POI20, 21,22. Недавно было сообщено, что расстройства аутистического спектра с задержкой развития и проблемы в социальном поведении представлены у детей с перестановкой FMR1 аллелей23,24.
Для определения точного cGG повторить размер имеет большое значение для классификации и прогнозирования FXS и хрупкие X-ассоциированных расстройств25,26. Исторически сложилось так, что CGG повторить регион-специфических полимеразы цепной реакции (PCR) с размером фрагмента плюс анализ южной подевой были золотым стандартом для молекулярного профилирования FMR1 CGG повторить27. Тем не менее, традиционные специфические ПЦР менее чувствительны к большим премутации с более чем 100 до 130 повторов и не способен к усилению полной мутации27,28. Кроме того, капиллярный электрофорез на традиционном генетическом анализаторе для повторного калибровки не обнаруживает продукты ПЦР FMR1 с более чем 200 cGG повторами. Анализ южной подётой поля позволяет дифференизировать более широкий диапазон повторяющихся размеров, от нормальных до полных мутаций повторяющихся чисел, и широко используется для подтверждения полных мутаций (у мужчин) и дифференциации гетерозиготных аллелей с полной мутацией от по-видимому гомозиготные аллели с нормальными размерами повтора (у женщин). Однако резолюция для количественной оценки повторов ограничена. Что еще более важно, эта пошаговая стратегия тестирования является трудоемкой, трудоемкой и неэффективной с точки зрения затрат.
Здесь мы представляем точный и надежный метод на основе ПЦР для количественной оценки CGG повторов FMR1. Первым шагом этого теста является pcR усиление повторяющихся последовательностей в 5’UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект. Продукты ПЦР очищаются, а размер фрагментов выполняется на микрофлюидном инструменте электрофорасиса капилляров, а последующая интерпретация количества CGG повторяется с помощью программного обеспечения анализа, ссылаясь на стандарты с известными повторами, основанными на обоснование того, что длина фрагмента ПЦР прямо пропорциональна количеству повторов CGG. Система ПЦР включает в себя реагенты, которые облегчают усиление высоко богатой ГК области тринуклеотида. Этот ПЦР-ассес воспроизводим и способен идентифицировать все диапазоны CGG повторов промоутеров FMR1. Это экономически эффективный метод, который может найти широкое применение в молекулярной диагностики и скрининга FXS и хрупких X связанных расстройств с меньшим оборотом вокруг времени и инвестиций в оборудование и, таким образом, могут быть использованы в более широком спектре клинических Лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
FXS является второй наиболее распространенной причиной интеллектуальных нарушений после трисомии 21, на долю которой приходится почти половина X-связанных умственной отсталости30, которые могут затронуть примерно 1 в 4000 мужчин и 1 в 8000 женщин. Что еще более важно, почти 1 из 250-10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами от NSFC Проект управления чрезвычайными ситуациями (Грант No 81741004), Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 81860272), Главный исследовательский план провинциального научно-технического фонда Гуанси ( Грант Но. AB16380219), Грант Фонда постдокторской науки (Грант No 2018М630993) и Гуанси-Фонд естественных наук (Грант No 2018GXNSFAA281067).
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
| FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
| FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
| NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Paper towels | |||
| PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
| reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
| S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
| TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |
References
- Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
- Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
- Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
- Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
- Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
- Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
- Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
- Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
- Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
- Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
- Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
- Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
- Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
- Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
- Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
- Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
- Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
- Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
- Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d’endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
- Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
- Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
- Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
- Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
- Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
- Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
- Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
- Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
- Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
- Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene–and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
- Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
- Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
- Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
- Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
- Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
- Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
- Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
- Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).
