Un virus de la grippe Luciferase-fluorescent Reporter pour l'imagerie en direct et la quantification de l'infection virale

Tous les protocoles impliquant des souris ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) et le Comité de biosécurité institutionnelle (IBC) de l’Université de Rochester, École de médecine et de dentisterie. Toutes les expériences réalisées sur des animaux suivent les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches58. Le Vivarium and Division of Laboratory Animal Medicine facilities de l’École de médecine et de dentisterie de l’Université de Rochester est accrédité par l’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International et aux lois fédérales et des États et à la politique des National Institutes of Health (NIH). Un équipement de protection personnelle (EPI) approprié est nécessaire lorsque vous travaillez avec des souris. Des politiques et des exigences similaires devraient être mises en œuvre lors de l’exécution d’expériences décrites dans ce manuscrit dans chaque institution. 1. Utilisation de petits animaux vertébrés Achetez des souris BALB/c femelles de cinq à sept semaines et entretenez-les dans l’établissement de soins aux animaux dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. À l’arrivée des souris dans les installations déterminées, prévoyez une période de repos de 4 à 5 jours pour permettre aux animaux de s’acclimater à leur nouvel environnement. Suivant les protocoles de l’IACUC, placez un maximum de 5 souris par cage.REMARQUE: À la fin de l’expérience, afin de s’assurer que l’animal est mort, les souris ont été euthanasiées à l’aide de deux procédures approuvées, en tenant compte du fait que la seconde doit être une méthode physique. Dans cette étude, après l’infection de souris avec BIRFLU et l’imagerie in vivo, les animaux sont euthanasiés avec une dose mortelle de 2,2,2-tribromoethanol (TBE), et en coupant la veine hépatique comme méthode secondaire physique comme nous l’avons précédemment montré23. 2. Biosécurité REMARQUE: Dans ce manuscrit, BIRFLU a été généré dans l’épine dorsale de la grippe A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), qui est une souche de laboratoire adaptée à la souris iAV23,32,33,56. Le virus a été généré à l’aide d’approches de génétique inverse à base de plasmides précédemment décrites et d’une description complète de la génération, et la caractérisation in vitro et in vivo de BIRFLU peut être trouvée dans notre récente publication55. Toutes les procédures impliquant des infections par le VI (in vitro ou in vivo) ont été effectuées dans un coffret de sécurité biologique dans des conditions de biosécurité (BSL)-2. MISE EN GARDE: Un niveau de biosécurité approprié devrait être déterminé conformément à une évaluation des risques pour la biosécurité. Des renseignements supplémentaires sur l’exécution d’évaluations des risques liés à la biosécurité et l’établissement d’un confinement efficace de la biosécurité devraient être consultés auprès de l’établissement où les expériences seront effectuées. Nettoyez les armoires de biosécurité avec 70 % d’éthanol ou de désinfectant au dioxyde de chlore avant et après avoir effectué toutes les procédures expérimentales. Pour le travail des souris, stériliser tous les matériaux de dissection (ciseaux, forceps disséquants, etc.) et l’homogénéisateur Dounce avant et après leur utilisation. Jetez tout le matériel biologique produit au cours des procédures en vertu des directives appropriées du BAC et de l’IACUC. 3. Caractérisation in vitro de BIRFLU (figure 2) REMARQUE: Consultez le tableau 1 pour toutes les compositions de mémoire tampon et de médias. Analyser l’expression des protéines par fluorescence (figure 2A) et l’immunofluorescence indirecte (figure 2B) Un jour avant l’infection, les plaques de semence24 puits avec madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellules épithéliales (1 x 105 cellules / puits, triplicates) dans les médias de culture tissulaire et de maintenir les plaques dans un incubateur de 37 oC avec 5% CO2. Préparez suffisamment de puits pour évaluer tous les anticorps choisis dans les cellules infectées par des simulacres et les cellules birFLU.REMARQUE: Nous recommandons de visualiser les cellules sous un microscope léger pour confirmer une monocouche avant de commencer l’infection virale. Une monocouche de confluence de 90% des cellules de MDCK au moment de l’infection est recommandée. Préparer des dilutions de WT ou BIRFLU IAVs dans les médias d’infection et infecter les cellules ensedutes MDCK avec une multiplicité d’infection (MOI) de 0,1 plaque-formation des unités (PFU) par cellule dans un volume final de 0,25 ml/puits de médias d’infection. Retirez le milieu de culture tissulaire de l’étape 3.1.1 et lavez les cellules MDCK deux fois avec 1x salin tamponné par phosphate (PBS). Ajouter les dilutions virales de 3.1.2 aux cellules MDCK et placer les plaques sur une plate-forme de bascule pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’adsorption virale.REMARQUE: Les cellules simulées ne sont incubées qu’avec des milieuis d’infection en l’absence de virus. Après l’adsorption virale (étape 3.1.3), retirez l’inoculum viral par aspiration et ajoutez 1 ml de support post-infection contenant 1 g/mL de trypsine TPCK-traitée à chaque puits. Incuber les cellules pendant 18 h dans un incubateur humidifié co2 à 33 oC. Après 18 h d’infection, retirez le supernatant de culture tissulaire des plaques de 24 puits (3.1.4). Fixer et perméabiliser les cellules avec 0,25 ml/puits de solution de fixation/perméabilisation pendant 20 min à température ambiante.REMARQUE: Préparer la solution de fixation/perméabilisation dans un capuchon de fumée pour éviter l’exposition au formaldéhyde. Retirez la solution de fixation/perméabilisation de l’étape 3.1.5, lavez les cellules deux fois avec 1x PBS, et incubez les cellules avec 0,25 ml/puits de solution de blocage pendant 1 h à température ambiante.REMARQUE: Passez à l’étape suivante ou entreposez les cellules dans une solution de blocage à 4 oC pendant la nuit. Retirez la solution de blocage (étape 3.1.6) et ajoutez 0,25 ml/puits (1 g/mL) d’un anticorps monoclonal de souris (MAb) contre la nucléoprotéine IAV, NP (HB-65) ou une dilution de 1:1 000 d’un anticorps polyclonal de lapin (pAb) contre NLuc (voir la Table des Matériaux), tous deux dilués dans la solution de dilution d’anticorps (1x PBS, 2,5% BSA), et incubent les cellules pendant 1 h à 37 oC. Retirez l’anticorps primaire de l’étape 3.1.7, lavez les cellules trois fois avec 1x PBS et incubez-les avec 0,25 ml/puits d’un anti-souris ou d’anticorps secondaires anti-lapins du Texas (voir le Tableau des matériaux) dilué 1:200 dans l’anticorps solution de dilution.REMARQUE: Les noyaux cellulaires peuvent être tachés en même temps en ajoutant 0,5 g/mL de 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI) à la même solution d’anticorps secondaire. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 oC dans l’obscurité. D’autres anticorps secondaires conjugués à d’autres fluorophores peuvent être utilisés. Retirez l’anticorps secondaire et Le DAPI de l’étape 3.1.8, lavez les cellules trois fois avec 1x PBS. Après le lavage, laisser les cellules dans 0,25 ml/puits de 1x PBS. Placez la plaque sur le stade d’un microscope à fluorescence pour détecter l’expression des journalistes de Vénus et Nluc, et NP à partir de cellules infectées à l’aide des filtres fluorescents appropriés. Capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence (grossissement 20x) et fusionnez-les à l’aide d’un logiciel d’édition d’images (Figure 2A, B). Analyser l’activité du Nluc (Figure 2C) et la réplication virale (Figure 2D). Un jour avant l’infection, les plaques de semences de 12 puits avec des cellules MDCK (2 x 105cellules/bien, tripliciates) utilisant des supports de culture tissulaire dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pour atteindre environ 90 % de confluency au moment de l’infection.REMARQUE: Avant l’infection, vérifiez les cellules au microscope pour vérifier une monocouche de cellules MDCK. Le jour de l’infection prépare des dilutions des virus WT et BIRFLU dans les médias d’infection pour infecter les cellules MDCK (étape 3.2.1.) dans le triplement avec un MOI de 0.001 PFU dans 0.5 mL/puits. Enlever le milieu de culture tissulaire et laver les cellules MDCK deux fois avec 1x PBS. Ajouter les dilutions virales aux monocouches MDCK et permettre l’adsorption virale à température ambiante pendant 1 h sur une plate-forme à bascule. Après l’adsorption virale, retirez l’inoculum du virus et ajoutez 1,5 ml de support post-infection contenant 1 g/mL de trypsine traitée par TPCK, à chaque puits. Incuber les cellules infectées dans un incubateur humidifié au CO2 de 5 % à 33 oC et recueillir des supernatants aux points indiqués à l’étape 3.2.4. À 24, 48, 72 et 96 h après l’infection (p.i.) recueillir 150 L de supernatant de culture tissulaire de chaque puits et stocker les échantillons dans un tube de microcentrifuge à -80 oC pour effectuer les essais Nluc et les titres viraux. Pour effectuer l’exemple d’activité Nluc, suivez les indications du fabricant. Tout d’abord, décongeler le supernatant de culture tissulaire stocké à -80 oC (étape 3.2.4) sur la glace.REMARQUE: Reportez-vous aux recommandations du fabricant et optimisez l’analyse si nécessaire. Préparer la solution d’analyse de luciferase (voir la Table des Matériaux) en diluant le substrat Nluc 1:50 avec le tampon de dilution. Dans une microplaque blanche à fond plat de 96 puits pour les essais de luciferase, mélangez 25 ll de solution d’analyse de luciferase avec 10 à 25 l des échantillons de supernatant de culture de tissu recueillis. Incuber le mélange pendant 2 à 3 minutes avant de mesurer la luminescence à l’aide d’un luminomètre (figure 2C).REMARQUE: La présence de particules virales infectieuses dans la culture tissulaire des supernatants est déterminée par l’analyse immunitaire-focus de fluorescence (Vénus) ou l’immunofluorescence indirecte (coloration virale d’antigène) comme précédemment décrit23,32, 33,56. Un jour avant les titrations virales, les cellules de Semence MDCK dans une plaque de 96 puits (2 x 104 cellules/puits, tripliques) avec des supports de culture tissulaire et permettent aux cellules d’atteindre 90% de confluence au moment de l’infection dans un incubateur réglé à 37 oC avec 5% de CO2. Utilisez les échantillons de supernatant de culture tissulaire qui ont été décongelés sur la glace (étape 3.2.4.). Ajouter 90 lde de support d’infection à chacun des puits dans une nouvelle plaque de 96 puits, puis ajouter 10 l de la culture tissulaire décongelée supernatant (étape 3.2.4) au premier puits (rangée A). Utiliser une tuyauterie multicanal pour mélanger et transférer 10 L de la rangée A à la rangée B. Changez les pointes entre les dilutions et mélangez bien.REMARQUE: Cette procédure doit être répétée jusqu’à la dernière rangée (H). Nous recommandons d’effectuer des titrations virales dans des tripliques pour une mesure précise des titres viraux. Retirez le milieu de culture tissulaire des cellules MDCK dans les plaques de 96 puits (étape 3.2.7) et lavez deux fois avec 1x PBS. Ajouter 50 L des dilutions supernatant de la plaque de 96 puits contenant les dilutions virales (étape 3.2.8) à chaque puits dans la plaque de 96 puits contenant des cellules MDCK. Incuber la plaque de 96 puits sur une plate-forme à bascule pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’adsorption virale. Après l’adsorption virale, retirez l’inoculum et ajoutez 100 L/puits de support post-infection contenant 1 g/mL de trypsine traitée par TPCK. Incuber les cellules infectées pendant 12 h dans unincubateur de 33 oC avec 5 % de CO 2. Depuis BIRFLU exprime Vénus, le nombre de cellules infectées peut être directement compté à l’aide d’un microscope à fluorescence. Alternativement, les titreleurs viraux peuvent être déterminés par immunofluorescence indirecte comme précédemment décrit utilisant un anticorps contre une protéine virale23,56,57,59. Pour ce dernier, procéder à la correction /perméabilize des cellules et la tache en utilisant l’anti-NP mAb HB-65 tel que décrit dans la section 4.4. Déterminer les titreleurs viraux en comptant le nombre d’unités fluorescentes (FFU)/mL à l’aide de la formule : ((nombre de FFU) x 20 x 1/dilution (Figure 2D). 4. Caractérisation in Vivo de BIRFLU (Figure 3 et Figure 4) Infection de sourisREMARQUE : L’infection intranasale des souris a été faite comme précédemment décrit23. Pour un protocole plus détaillé de l’infection par le VI in vivo en utilisant le modèle de souris de l’infection, nous vous recommandons de visionner la vidéo associée à la publication précédente23. Cette section résume seulement les étapes requises pour l’infection de souris avec BIRFLU. Inspecter les souris pour évaluer leur santé et leur apparence physique globale. Préparer la dilution de BIRFLU en 1x PBS pour inoculer les souris avec 1 x 106 PFU de BIRFLU dans un volume total de 30 L/souris. Maintenir le virus sur la glace jusqu’à l’inoculation de la souris.REMARQUE: Des souris simulées (1x PBS) seront nécessaires comme contrôle interne pour l’imagerie. Placez des souris simulées dans une cage différente de celle des animaux infectés par le BIRFLU. Anesthésiez des souris BALB/c femelles de cinq à sept semaines par voie intrapéritone avec 240 à 250 mg/kg de tribromoéthanol (TBE) en insérant l’aiguille dans le caudal 2/3 du côté droit de l’abdomen. Ensuite, retournez la souris dans la cage et attendez environ 5 min. Vérifiez que la souris est anesthésié avant l’inoculation du virus par l’absence du réflexe de pincement des orteils.REMARQUE: Les sédatifs injectables sont recommandés sur les sédatifs inhalés pour les infections grippales in vivo, car ces derniers peuvent modifier le comportement et l’utilisation du virus par l’épithélium des voies respiratoires. En outre, ils peuvent également affecter les réponses immunitaires locales du poumon et interférer avec l’imagerie in vivo des souris infectées. Enfin, les sédatifs inhalés ont réduit la durée d’effet, ce qui constituerait un problème pour l’imagerie in vivo des animaux infectés. Inoculer les souris intranasally avec les 30 L de la dilution BIRFLU préparée. Vérifiez que les souris respirent correctement avant de les retourner à la cage. Surveillance de la bioluminescence des souris infectées par BIRFLU (Figure 4A)REMARQUE: Dans ce manuscrit, l’expression de Nluc ou de Vénus et la réplication virale dans les poumons de souris infectées par BIRFLU sont déterminées à 3 jours après l’infection. Cependant, la nature de l’imagerie par bioluminescence permet une surveillance répétée de l’expression de Nluc chez des animaux infectés par le BIRFLU sans qu’il soit nécessaire de les euthanasier pour chaque période expérimentale. Un système de formation image in vivo avec un collecteur d’anesthésie d’isoflurane est exigé pour exécuter les procédures expérimentales décrites. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails concernant l’instrument d’imagerie et le logiciel d’image utilisés pour l’acquisition d’images et l’analyse des données. Raser la poitrine des souris pour améliorer le signal de bioluminescence. Ouvrez le logiciel d’imagerie et appuyez sur Initialize. Ensuite, définiz les paramètres qui seront utilisés, y compris la mise en mode d’imagerie à la bioluminescence, l’économie automatique, le temps d’exposition à l’automobile, filtre ouvert, etc. Une fois que la machine est entièrement paraphée, allumez le système d’anesthésie isoflurane. Placer les animaux dans la chambre d’anesthésie. Les souris sont simultanément et légèrement anesthésiées avec un mélange de gaz d’oxygène et d’isoflurane vaporisé de 1 à 2 %. Une fois que les souris sont anesthésiées, administrer le substrat Nluc (voir le Tableau des matériaux)dilué 1:10 en 1x PBS (volume final 100 l/souris) par voie rétro-orbitale à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 22 G. Immédiatement après l’administration du réactif Nluc, placez les animaux dans l’instrument d’imagerie avec leurs poitrines orientées vers le haut et le museau à l’intérieur du cône multiple pour garder les animaux anesthésiés pendant l’imagerie. Immédiatement après la fermeture de la porte de l’imageur, cliquez sur Acquérir dans le logiciel (Figure 4A, en haut). Après l’imagerie, renvoyez les souris dans leurs cages en les surveillant jusqu’à ce qu’elles aient complètement récupéré et éteignez le vaporisateur d’isoflurane. Ensuite, procédez à l’imagerie ex vivo des poumons de souris pour évaluer l’expression du gène de journaliste de Vénus (section 4.3). Utilisez les outils logiciels d’imagerie pour analyser les données de bioluminescence acquises. Utiliser l’outil ROI (région d’intérêt) pour désigner le signal spécifique et effectuer des mesures de flux dans la région d’intérêt (généralement autour de la poitrine) (Figure 4A, en bas). Bien que la forme du retour sur investissement ne soit pas pertinente, les iA plus importants sont généralement préférables pour capturer toute la zone de diffusion du signal. Cliquez sur Mesure. Évaluer la bioluminescence dans les photons puisqu’elle fournit une mesure absolue des émissions de photons qui est comparable aux mesures de sortie fournies par différents paramètres ou instruments d’imagerie. Analyse de fluorescence chez les souris infectées par BIRFLU (Figure 3 et Figure 4B) Recueillir les poumons de la souris après l’imagerie in vivo, comme précédemment décrit23. En bref, euthanasiez les souris avec une dose mortelle de TBE (500 mg/kg). Désinfecter le site d’incision avec 70% d’éthanol. À l’aide d’un scalpel, faire une incision du sternum à la base de l’abdomen, puis couper du bas de l’incision sur les côtés avec des ciseaux. Ensuite, couper la veine hépatique (deuxième méthode d’euthanasie physique) pour saigner l’animal.REMARQUE: Pour éviter le signal de fond élevé pendant l’imagerie, il est important de réduire au minimum la quantité de sang dans les poumons (voir ci-dessous). Placez la souris dans la charge dorsale, et utilisez les ciseaux pour couper la pleure et ouvrir la cage thoracique. Par la suite, retirer les poumons en arrachant l’extrémité de la trachée avec des ciseaux tout en tenant doucement les poumons avec des forceps. Placer les poumons dans une plaque de six puits avec 2 ml de 1x PBS et laver les poumons trois fois avec 1x PBS.REMARQUE: Pour éviter la contamination entre les échantillons, nettoyez et désinfectez les outils de dissection entre chaque animal. Démarrez le logiciel d’acquisition d’images en cliquant sur initialiser et définir les paramètres pour l’imagerie, y compris le réglage du mode d’imagerie à la fluorescence, l’économie automatique, le temps d’exposition à l’automobile, l’excitation (500 nm) et les filtres d’émission (540 nm). Lorsque la machine est paraphée, placez les poumons dans un plateau de fond noir, en veillant à ce que les tissus sont séparés les uns des autres, introduisez le plateau dans l’imageur, et cliquez sur Acquérir sur le programme du système d’imagerie après la fermeture de la porte de l’imageur ( Figure 4B, en haut). Après l’imagerie, retirer immédiatement les tissus et les conserver sur de la glace (4 oC) si les échantillons sont traités le jour même; ou sur un tube et de la glace sèche pour les congeler rapidement, avant de les stocker à -80 oC, si les échantillons seront traités plus tard un autre jour. Pour le traitement de l’image, sélectionnez l’outil de retour sur investissement et dessinez des ROIs autour de chacun des poumons individuels. Cliquez sur Mesure. Ensuite, à l’aide des mesures moyennes d’efficacité radiante qui en résultent, soustrayez les valeurs des souris infectées par une simulacre (figure4B,en bas).REMARQUE: Avec BIRFLU, il ya une bonne corrélation des niveaux d’expression De Nluc et Vénus, et la distribution du signal. Par conséquent, il est important d’analyser l’expression de Nluc (souris entière) et De vénus (poumons excisés) du même animal, et de maintenir la même orientation. Évaluation de la réplication DU BIRFLU dans les poumons des souris (figure3 et figure 4C) Homogénéiser les poumons des souris pour la titration virale par l’assay de plaque comme précédemment décrit23. Placer les poumons dans un homogénéisateur Dounce avec 1 ml de support d’infection réfrigérée. Homogériser les poumons avec le pilon pendant 1 min à température ambiante jusqu’à ce qu’il se soit complètement désintégré et stocker les échantillons dans un tube stérile à 4 oC. Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min et recueillir le supernatant dans un tube stérile. Entreposez les échantillons sur la glace s’ils seront utilisés le même jour ou congelez-les à -80 oC pour évaluer les titreleurs viraux à une date ultérieure.REMARQUE: Un nouvel homogénéisateur Dounce doit être utilisé pour chaque échantillon pulmonaire. Pour effectuer l’analyse de plaque, la veille de l’exécution de la titration virale, les plaques de semence de six puits avec des cellules MDCK (5 x 105 cellules/ bien) dans les médias de culture tissulaire. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 oC avec 5 % de CO2 pour atteindre 90 % de confluence le lendemain. Avant l’infection, confirmer que les cellules forment une monocouche sous un microscope léger. Préparer 1:10 dilutions sérielles du supernatant à partir des échantillons homogénéisés (étape 4.4.1) dans les médias d’infection. Préparer les tubes de microcentrifugeavec 540 l de supports d’infection, ajouter 60 L de l’échantillon de poumons homogénéisés au premier tube, mélanger en pipetting de haut en bas, puis en utilisant une nouvelle pointe, transférer 60 ‘L au tube suivant. Répétez ce processus de dilution en série jusqu’à la dernière dilution.REMARQUE: Dans notre expérience 7 dilutions sont suffisantes pour déterminer les titreleurs viraux par l’assay de plaque des poumons des souris infectées. Laver les cellules MDCK (étape 4.4.3) deux fois avec 1x PBS et transférer 500 L des échantillons dilués en série à chaque puits dans la plaque de six puits. Placer les plaques sur une plate-forme de bascule et permettre l’absorption virale de se produire pendant 1 h à température ambiante. Après 1 h d’absorption virale, retirez l’inoculum viral, ajoutez 2 mL/puits de milieu de superpose contenant 1 g/mL de trypsine traitée par TPCK, puis incubez les cellules à 33 oC sous 5 % de CO2 pendant 3 jours. Fixer les cellules infectées (étape 4.4.6) avec 1 ml/puits de 4% de formaldéhyde dilué dans 1x PBS à température ambiante pendant 2 h, puis retirer soigneusement le milieu de superposition et ajouter 1 ml de 1x PBS à chaque puits. Pour la visualisation de Vénus, imagez les plaques de six puits avec un système d’imagerie pour la détection de la fluorescence.REMARQUE: Les plaques virales peuvent être colorées à l’aide d’un logiciel d’édition d’images (voir le Tableau des matériaux). Pour évaluer l’expression de Nluc, visualisez les plaques virales en immunostaining utilisant un pAb anti-Nluc. Pour cela, retirer les 1x PBS, les cellules perméabilize en utilisant 0,5 ml/puits de solution de perméabilisation pendant 15 min à température ambiante. Retirez la solution de perméabilisation, lavez les cellules trois fois avec 1x PBS et bloquez avec 0,5 ml/puits de solution de blocage pendant 1 h à température ambiante. Retirez la solution de blocage de l’étape 4.4.9 et incubez les cellules avec 0,5 ml/puits de l’anti-Nluc pAb dilué 1:1,000 dans la solution de dilution pendant 1 h à 37 oC. Utilisez le kit ABC Alkaline Phosphatase et le Kit substrat Peroxidase DAB suivant la recommandation du fabricant pour la visualisation des plaques exprimant Nluc. En bref, laver les cellules à partir de 4,4,10 trois fois avec 1x PBS et les incuber avec 0,5 ml/puits d’anticorps secondaires anti-lapin biotinylated pendant 1 h à 37 oC. Retirez l’anticorps secondaire, lavez les cellules trois fois avec 1x PBS, et incubez avec la solution ABC pendant 1 h à 37 oC. Laver les cellules trois fois avec 1x PBS et visualiser les plaques virales avec le kit de substrat DAB HRP. Scanner les plaques immunostained à l’aide d’un scanner conventionnel.REMARQUE: D’autres kits similaires pour l’immunostaining pourraient être utilisés. Tachez les plaques virales avec une solution violette cristalline pendant 1 h à température ambiante. Jeter la violette de cristal, laver les assiettes trois fois avec de l’eau, laisser sécher les assiettes et scanner à nouveau les assiettes. Pour déterminer les titreneurs viraux, comptez les plaques révélées après la coloration de la violette cristalline. Scanner les plaques à l’aide d’un scanner conventionnel. Calculer le titre de virus sous forme d’unités de formation de plaque (PFU) par mL (PFU/mL). Pour évaluer la stabilité birFLU in vivo, calculez le pourcentage de virus exprimant des journalistes en comptant le nombre de plaques teintées de violette cristalline (nombre de virus infectieux, étape 4.4.12) et comparez avec le nombre de plaques exprimant Vénus et Nluc ( l’étape 4.4.7 et l’étape 4.4.11, respectivement).