Kitosan filmlerde ınsan periodontal ligament hücre kürleri oluşumu
Summary
Burada, insan periodontal bağ (PDL) hücre kürleri tarafından kitosan filmleri ile ilgili protokoller sunuyoruz. Üç boyutlu (3D) hücresel küreler kültürü geleneksel doku kültürü Polistiren (TCPS) kültür sistemine bir alternatif sağlar.
Abstract
Periodontal bağ (PDL) hücreleri periodontal doku rejenerasyonu için büyük söz tutun. Geleneksel olarak, PDL hücreleri doku kültürü Polistiren (TCPS) gibi iki boyutlu (2D) substratlar üzerinde kültürlü. Ancak, In vitro kültürü sırasında PDL hücrelerinin karakteristik değişiklikleri gözlenmiştir. Bu fenomen muhtemelen 2D TCPS in vivo üç boyutlu (3D) mikroortamdan farklıdır çünkü. 2B substratlar üzerinde kültürlü hücrelere kıyasla, bir 3D mikroortamda yetiştirilen hücreler in vivo hücrelere daha fazla benzerlik sergiler. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü için umut verici bir alternatif sağlar. Geleneksel PDL hücre kültürü modellerini geliştirmek için, son zamanlarda kitosan filmleri üzerinde PDL hücrelerinin küroid oluşumuna dayanan bir 3D hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Burada, kitosan filmlerine dayanan detaylı hücre kürü kültürü protokolleri sunuyoruz. PDL hücresel kürenin 3D kültür sistemi, geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürüyle ilgili bazı sınırlamaların üstesinden gelmekte ve böylece gelecekteki periodontal doku rejenerasyonu için gelişmiş bir terapötik etkinliğine sahip PDL hücrelerini üretmek için uygun olabilir.
Introduction
Periodontitis, esas olarak dental plak1ile başlatılan, periodontal bağ (PDL), alveoler kemik ve Periodontitis için mevcut tedaviler genellikle aktif hastalığın ilerlemesini önlemede başarılı olmaktadır, ancak kayıp periodontal dokularda rejenerasyon klinik bir zorluk olarak kalır. Son zamanlarda, periodontal doku rejenerasyonu için hücre tabanlı yaklaşımlar mevcut tedaviler2,3,4dezavantajları aşmak için önemli ilerleme yapılmıştır.
Önceki sistematik incelememiz, PDL hücrelerinin periodontal rejenerasyon için büyük bir potansiyel gösterdiğini göstermiştir5. Geleneksel olarak, PDL hücreleri doku kültürü Polistiren (TCPS) gibi iki boyutlu (2D) substratlar üzerinde kültürlü. Ancak, In vitro Culture6sırasında PDL hücrelerinin karakteristik değişiklikleri gözlenmiştir. Bu fenomen muhtemelen 2D TCPs in vivo üç boyutlu (3D) mikro7farklıdır çünkü. 2B substratlar üzerinde kültürlü hücrelere kıyasla, bir 3D mikroortamda yetiştirilen hücreler in vivo hücrelere daha fazla benzerlik sergiler8. Bu nedenle, 3D hücre kültürü modelleri geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü için umut verici bir alternatif sağlar.
Konvansiyonel 3D kültür yöntemi hücreleri 3D Biyomalzemeler kapsüller. 3D biyomalzemelerde kapsüllenmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, hücresel küreler daha yakından In vivo durumu taklit, çünkü kürüler yabancı maddelerin ücretsiz büyüyen hücrelerin toplamları vardır9,10,11, 12. hücresel KÜRLERIN msc biyofaaliyetlerini fibronektin ve laminin13dahil olmak üzere, ekstrasellüler matriks (ECM) bileşenlerinin korunması yoluyla tanıtılmasıdır. Geleneksel PDL hücre kültürü modellerini geliştirmek için, son zamanlarda kitosan filmler14PDL hücrelerinin küroid oluşumuna dayalı BIR 3D PDL hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Küroid oluşumu PDL hücrelerinin Self-yenilenme ve osteogenik farklılaşma kapasitelerini artırmıştır14. Burada, kitosan filmlerine dayanan ayrıntılı PDL hücre kürü kültür protokolleri sunuyoruz. PDL hücresel kürenin 3D kültür sistemi, geleneksel TCPS hücre kültürüyle ilgili eksikliklerin bazılarını aşmak ve böylece gelecekteki periodontal doku rejenerasyonu için gelişmiş bir terapötik etkinliğine sahip PDL hücrelerini üretmek için uygun olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, geleneksel 2D Tek tabakalı hücre kültürü ile ilgili bazı sınırlamalar aşmak için bir 3D hücre kültür sistemi tanıttı. Protokole göre PDL hücresel kürüler, kitosan filmlerinde kültür hücreleri tarafından başarıyla oluşturuldu. Önceki çalışmamızda, küresel oluşumunun PDL hücrelerinin Self-yenilenme ve osteogenik farklılaşma kapasitelerinin artması bildirildi14. TCPs gelen hücreler hasat için bir enzim kullanmak yerine, PDL hücre küreler sadec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NSFC 81700978), orta üniversiteler için temel araştırma fonları (1504219050), Şangay doğal Bilim Vakfı (17ZR1432800) ve Şangay Medikal keşif projesi ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. 암 연구학. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
