Изоляция Ламина Проприа моноядерных клеток из Курина толстой с использованием коллагеназа E

Хотя желудочно-кишечного тракта (ГИ) в первую очередь посвященобработке и реабсорбции питательных веществ из пищи, желудочно-кишечный тракт также поддерживает центральную роль в целостности сосудистой, лимфатической и нервной систем и многих других органов через его слизистой и субмукозной иммунной системы¹. Иммунная система GI имеет влиятельную роль как в желудочно-кишечном и системном здоровье из-за его постоянного воздействия иностранных антигенов из пищи, сопутствующих бактерий, или вторжение патогенов^1,2. Таким образом, иммунная система Г.И. должна поддерживать хрупкий баланс, в котором она переносит непатогенные антигены, адекватно реагируя на патогенные антигены^1,2. Когда нарушается баланс толерантности и защиты, локализованы или системной иммунной дисрегуляции и воспаления может произойти в результате множества заболеваний^1,2,3.

Кишечник таит в себе не менее 70% всех лимфоидных клеток в организме^4. Большинство первичных иммунологических взаимодействий включают по крайней мере одну из трех иммунных станций в кишечнике: 1) Патчи Пейера, 2) Интраэпителиальные лимфоциты (IEL) и 3) лимины проприа лимфоциты (LPL). Каждый из них состоит из сложной взаимосвязанной сети иммунных клеток, которые быстро реагируют на нормальные иммунные проблемы в кишечнике^5. Ограниченный строма выше muscularis слизистые оболочки, слабо структурированные ламины propria является соединительной ткани слизистой оболочки кишечника и включает в себя леса для villus, сосуды, лимфатический дренаж, и слизистой нервной системы, а также многие врожденные нервной системы и адаптивные иммунные подмножества^6,7,8,9. LPL состоят из CD4^{и CD8} Т-клеток в приблизительном соотношении 2:1, плазматические клетки и миелоидные клетки линии, включая, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и макрофаги⁶.

Существует растущий интерес к пониманию иммунной дисрегуляции и воспаления кишечника, как это относится к различным состояниям заболевания. Такие условия, как болезнь Крона и язвенный колит все проявляются различные уровни воспаления толстой кишки^10,11,12. Кроме того, у пациентов со злокачественными или незлокачественными расстройствами костного мозга или иммунной системы, которые проходят аллогенную трансплантацию костного мозга (алло-БМТ), могут развиться различные формы колита, включая 1) прямую токсичность от схем кондиционирования до BMT, 2) инфекций, вызванных иммуносупрессией после BMT и 3) трансплантата против хозяина болезни (GVHD) обусловлен донора типа Т-клеток, реагирующих на донора алло-антигенов в тканях после BMT^13,14,15. Все эти пост-BmT осложнений приводят к значительным изменениям в иммунной среде кишечника^16,17,18. Предлагаемый метод позволяет надежную оценку накопления иммунных клеток в толстой кишке мыши и, при применении к получателям мурина после BMT, облегчает эффективное анализ как донора, так и реципиента иммунных клеток, участвующих в переноске трансплантации^{19 ,20}. Дополнительные причины воспаления кишечника включают злокачественные новообразования, пищевую аллергию или нарушение микрофлоры кишечника. Этот протокол позволяет получить доступ к кишечной моноядерной клетке из толстой кишки и, с модификациями, к лейкоцитам тонкой кишки в любой из этих доклинических моделей мурин.

Поиск PubMed с использованием поисковых терминов “intestine And immune cell And isolation” показывает более 200 публикаций, описывающих методы пищеварения тонкой кишки для извлечения иммунных клеток. Однако, подобный поиск словесности для двоеточия не дает никакие well-delineated протоколы определяя изоляцию иммунных клеток от двоеточия. Это может быть потому, что двоеточие имеет более мышечной и интерстициальной слоев, что делает его более трудным для полного переваривания, чем тонкой кишки. В отличие от существующих протоколов, этот протокол специально использует Коллагеназа E от Clostridium histolyticum без других бактериальных коллагенезов (Collagenase D/ Коллагеназа I). Мы демонстрируем, что, используя этот протокол, пищеварение толстой ткани может быть достигнуто при сохранении качества изолированных кишечных моноядерных иммунных клеток (MNC) без добавления анти-слипающихся реагентов, таких как версенат натрия (EDTA), Dispase II, и дезоксирибонуклеэI (DNAse I)^21,22,23. Этот протокол оптимизирован, чтобы позволить воспроизводимой надежной добычи жизнеспособной MNC из толстой кишки для дальнейших направленных исследований и должны поддаваться на изучение иммунологии толстой кишки или (с модификациями) тонкой кишки^{24, 25}.