Summary

Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

Published: March 10, 2020
doi:

Summary

Cloniamo e analizziamo i geni dei reporter generando RNA circolari. Questi geni reporter sono più grandi dei costrutti per analizzare lo splicing lineare e contenere elementi Alu. Per studiare gli RNA circolari, i costrutti vengono trasfettati in cellule e l’RNA risultante viene analizzato utilizzando RT-PCR dopo la rimozione dell’RNA lineare.

Abstract

Oltre agli mRNA lineari, molti geni eucarioti generano RNA circolari. La maggior parte degli RNA circolari sono generati dall’unendo un sito di giunzione di 5′ con un sito di giunzione a monte a monte di 3′ all’interno di un pre-mRNA, un processo chiamato back-splicing. Questa circolarizzazione è probabilmente aiutata da strutture secondarie nel pre-mRNA che portano i siti di giunzione in stretta vicinanza. Nei geni umani, si pensa che gli elementi alu promuovano queste strutture secondarie dell’RNA, poiché gli elementi Alu sono abbondanti e presentano complementarità di base tra loro quando sono presenti in direzioni opposte nel pre-mRNA. Qui, descriviamo la generazione e l’analisi di grandi elementi Alu contenenti geni reporter che formano RNA circolari. Attraverso l’ottimizzazione dei protocolli di clonazione, è possibile generare geni reporter con una lunghezza di inserto fino a 20 kb. La loro analisi negli esperimenti di co-trasfezione consente l’identificazione di fattori normativi. Pertanto, questo metodo può identificare le sequenze di RNA e i componenti cellulari coinvolti nella formazione circolare dell’RNA.

Introduction

RNA circolari
Gli RNA circolari (circRNA) sono rna a singolo spiaggiamento chiusi covalentmente chiusi che sono espressi nella maggior parte degli organismi. Vengono generati unendo un sito di giunzione a un downstream 5′ a un sito di giunzione a monte 3′, un processo chiamato back-splicing (Figura 1A)1. Le sequenze nel pre-mRNA che presentano una base complementare fino a 30-40 nt portano i siti di giunzione posteriore in un corretto allineamento per la formazione di circRNA2. Nell’uomo, gli elementi Alu 1, che rappresentano circa l’11% del genoma3, formano ampie strutture di RNA a doppio filamento nel pre-mRNA a causa della loro auto-complementarità4,5 e quindi promuovono la formazione di circRNA1.

Attualmente, sono state descritte tre funzioni principali dei circRNA. Alcuni circRNA legano microRNA (miRNA) e attraverso il sequestro agiscono come spugne di miRNA6. I circRNA sono stati implicati nella regolazione trascrizionale e post trascrizionale, attraverso la concorrenza con la giunzione lineare7 o la modulazione dell’attività del fattore di trascrizione8. Infine, i circRNA contengono brevi cornici di lettura aperte e studi di prova di principio dimostrano che possono essere tradotti9,10. Tuttavia, la funzione della maggior parte dei circolrRNA rimane enigmatica. La maggior parte degli RNA circolari è stata rilevata utilizzando i metodi di sequenziamento di nuova generazione11. Analisi dettagliate di singoli geni utilizzando approcci RT-PCR mirati rivelano che un gran numero di RNA circolari rimane da scoprire12.

Uso dei geni dei reporter per analizzare l’elaborazione pre-mRNA
L’analisi dell’mRNA derivato dai costrutti di segnalazione del DNA trasinfezione in cellule è un metodo ben consolidato per studiare lo splicing pre-mRNA alternativo, che può essere applicato agli RNA circolari. In generale, l’eson alternativo, gli introni circostanti e gli estrusioni coniugali vengono amplificati e clonati in un vettore di espressione eucatra. Spesso, gli introni sono accorciati. I costrutti sono trasfettati in cellule eucariotiche e di solito analizzati da RT-PCR13,14. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per mappare i siti di giunzione regolamentare e i fattori di trans-azione negli esperimenti di co-trasfezione13,15,16,17,18. Inoltre, la generazione di minigeni proteici ha permesso lo screening di sostanze che cambiano lo splicing alternativo19,20.

Il metodo è stato applicato agli RNA circolari. Attualmente, almeno 12 backbone minigene sono stati descritti nella letteratura e sono riassunti nella tabella 1. Ad eccezione del sistema di espressione basato sul tRNA21,22, tutti dipendono dai promotori di polimerasi II. Qui, descriviamo un metodo per generare minigeni di reporter umani per determinare i fattori di cis e trans-azione coinvolti nella generazione di RNA circolari. Una panoramica del metodo che utilizza sequenze di un reporter genepubblicato 23 è illustrata nella Figura 1.

Protocol

1. Progettazione dei costrutti Utilizzare il browser genoma UCSC24 per identificare gli elementi ripetitivi necessari per la formazione circolare di RNA e incorporarli nei costrutti. È importante sottolineare che i numeri di forza per l’amplificazione devono essere al di fuori degli elementi ripetitivi. Incollare la sequenza circolare dell’RNA (Supplemental Figure 1 è una sequenza di prova) in <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start" tar…

Representative Results

I geni dei reporter consentono la determinazione di fattori regolatori che influenzano la formazione circolare dell’RNA. Tuttavia, questi geni reporter sono grandi e contengono elementi ripetitivi che spesso rendono instabili i costrutti del DNA. A causa delle loro grandi dimensioni, è spesso necessario eliminare parti degli introni, che si ottiene amplificando i pezzi genomici contenenti gli esoni e le parti intronica laterali più piccole. Questi pezzi di DNA sono assemblati enzimaticamente, permettendo la costruzione…

Discussion

In generale, gli RNA circolari sono bassi abbondanti1, il che complica lo studio della loro funzione e formazione. Simile agli RNA lineari13, l’uso di minigeni reporter permette l’identificazione di cis e fattori trans-agire che regolano la formazione di RNA circolari. Pertanto, questo approccio genera ipotesi che possono essere ulteriormente testate utilizzando i geni endogeni.

Il passo più critico è la progettazione del gene reporter. L’assem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa DoD grant A-180075. Stefan Stamm ringrazia Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin è stata supportata dal DAAD, programma di scambio accademico tedesco, Justin R. Welden ha ricevuto il premio Max Steckler Award dell’Università del Kentucky.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main

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Cite This Article
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).

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