Здесь мы представляем протокол ампутации фаланги терминала для взрослых мышей для исследования образования бластемы млекопитающих и интрамембранной окостенации, анализируемый флуоресцентной иммуногистохимией и последовательной микрокомпьютерной томографией in-vivo.
Здесь мы представляем протокол взрослой мыши дистальной терминальной фаланги (P3) ампутации, процедурно простой и воспроизводимой модели эпиморфной регенерации, которая включает в себя формирование бластемы и интраимбранное окосяждение, проанализированные флуоресценция иммуногистохимия и последовательная микрокомпьютерная томография in-vivo (ККТ). Регенерация млекопитающих ограничивается ампутациями, трансектирующие дистальную область терминальной фаланги (P3); цифры, ампутированные на более проксимальных уровнях, не могут регенерировать и проходят фиброзное заживление и образование рубцов. Реакция регенерации опосредована образованием пролиферативной бластемы, а затем регенерацией костей через интраимбранную окостенение для восстановления ампутированной скелетной длины. Ампутация P3 является доклинической моделью для исследования эпиморфной регенерации у млекопитающих, и является мощным инструментом для разработки терапевтических стратегий для замены фиброзного исцеления с успешной регенеративной реакции. Наш протокол использует флуоресценцию иммуногистохимии 1) определить ранне-поздние популяции бластемных клеток, 2) исследование реваскуляризации в контексте регенерации, и 3) исследовать интраммбранную окостенение без необходимости сложной кости стабилизационные устройства. Мы также демонстрируем использование последовательного in vivo зКТ для создания изображений с высоким разрешением для изучения морфологических изменений после ампутации, а также количественной оценки изменений объема и длины одной и той же цифры в ходе регенерации. Мы считаем, что этот протокол предлагает огромную полезность для исследования как эпиморфных, так и регенеративных реакций тканей у млекопитающих.
Млекопитающие, в том числе люди и мыши, имеют возможность регенерировать кончики своих цифр после дистальной ампутации терминальной фаланги (P3)1,2,3. У мышей реакция регенерации зависит от уровня ампутации; все более проксимальной ампутации цифрототвают постепенно ослабленный регенеративный ответ до полного регенеративного отказа при ампутации трансэктинга и проксимальной к матрице ногтей P34,5,6 , 7 (г. , 8. Регенерация P3 опосредована образованием бластемы, определяемой как популяция размножающихсяклеток, которые проходят морфогенез для регенерации ампутированных структур 9. Формирование бластемы для регенерации структур, потерянных в результате ампутации, процесс, называемый эпиморфной регенерации, отличает многотканьья уровня P3 регенерации ответ от традиционного восстановления тканей после травмы6, 10. Регенерация P3 является воспроизводимой и процедурно простой моделью для исследования сложных регенеративных процессов, включая заживление ран11,12,гистолиза костей11,12, реваскуляризации13, периферической регенерации нерва14, и бластремальной преобразования в кости через интраимбранную окостенение15.
Предыдущие исследования с использованием иммуногистохимии показали, что бластема неоднородна, аваскулярная, гипоксическая и высоко размножается11,13,15,16. После дистальной ампутации P3, ранняя бластема первоначально связана с периостеем P3 и эндостерией и характеризуется устойчивым распространением и зарождающимся остеогенезом, примыкающим к костной поверхности15. После деградации костей и замыкания раны, неоднородная бластема формируется в результате слияния периохальных и эндостел-ассоциированных клеток, за которыми следует дифференциация бластремальных компонентов, включая кости через интраимбранное окосоединение 15.
Ремонт костей в ответ на травму обычно происходит путем эндохондральной околения, т.е. через первоначальный хрящевой каллуса, который образует шаблон для последующего формирования костей17,18. Длинная косточка интраимбранной оковласти, т.е. формирование костей без хрящевого промежуточного, обычно индуцируется с помощью сложных отвлекающих устройств или хирургической фиксации19,20. Цифра регенерации ответ является доклинической моделью, которая предлагает преимущества по сравнению с обычными интраимбранной окотопительных моделей: 1) он не требует внешней или внутренней фиксации после травмы, чтобы стимулировать интраимбранной оковласти, 2) это выполняется с использованием 4 цифр от каждого животного, тем самым максимизируя образцы при минимизации использования животных, и 3) последовательный анализ микрокомпьютерной томографии in vivo (ККТ) может быть выполнен с легкостью и скоростью.
В настоящем исследовании мы показываем стандартизированную плоскость ампутации P3 для достижения воспроизводимой и надежной реакции регенерации. Кроме того, мы демонстрируем оптимизированный протокол иммуногистохимии флуоресценции с использованием парафиновых секций для визуализации образования бластемы, реваскуляризации в контексте регенерации и бластремального преобразования в кости через интраимбранные опрокидолизм. Мы также демонстрируем использование последовательного in-vivo зКТ для выявления изменений в морфологии костей, объеме и длине в одной и той же цифре в течение регенерации. Целью этого протокола является исследование образования бластеммлекопитающих после ампутации и демонстрация 2 методов, флуоресценции иммуногистохимии и последовательной in vivo зКТ, для изучения интраимбранной регенерации костей.
Этот протокол описывает стандартизированную процедуру взрослой мыши дистальной ампутации P3, флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание для визуализации и исследования образования бластемы и интраимбранной окостенения, а также последовательное сканирование in-vivo определить ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов лаборатории Muneoka и Техасского института геномной медицины (TIGM). Эта работа была поддержана Техасским университетом А И М.
Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
vivaCT 40 | SCANCO Medical |