Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.
Abstract
A apoptose celular é um processo natural e desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário, na regulação homeostática, na indução da tolerância imune e na resolução da inflamação. O acúmulo de detritos apoptóticos no corpo pode desencadear respostas inflamatórias crônicas que levam a doenças auto-imunes sistêmicas ao longo do tempo. O afastamento de pilha apoptóticas danificado foi implicado em uma variedade de doenças auto-imunes. A depuração apoptótica é um processo complexo raramente detectado em condições fisiológicas. Envolve receptores de superfície abundantes e moléculas de sinalização. Estudar o processo de liberação de células apoptóticas fornece mecanismos moleculares perspicazes e respostas biológicas subsequentes, o que pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas. Aqui, nós descrevemos protocolos para a indução de thymocytes apoptóticas, a preparação de macrófagos peritoneais, e a análise do afastamento de pilha apoptóticas pelo fluxo citometria e pela microscopia. Todas as células serão submetidas a apoptose em um determinado estágio, e muitas células residenciais e circulantes podem captação de detritos apoptóticos. Portanto, o protocolo descrito aqui pode ser usado em muitas aplicações para caracterizar a ligação e a ingestão de células apoptóticas por muitos outros tipos de células.
Introduction
Nosso corpo gera 1-10 bilhões de células apoptóticas em uma base diária. Um número tão grande de pilhas apoptóticas deve ser cancelado de uma maneira que as respostas imunes permaneçam quiescentes. Para garantir o despejo de células apoptóticas em tempo hábil, inúmeros tipos de células residentes no tecido e células circulantes desenvolvem mecanismos para engolfo células apoptóticas1. A regulação disfuncional da apoptose tem sido implicada no início e progressão de várias doenças inflamatórias e autoimunidade2. A apoptose também desempenha um papel crítico na patogênese do desenvolvimento do câncer e sua subsequente resistência aos tratamentos convencionais3,4. A remoção de células apoptóticas geralmente promove uma resposta anti-inflamatória, que pode estar ligada à tolerância imunológica5. A violação do afastamento de pilha apoptóticas conduz o Self-imunização e contribui ao desenvolvimento de doenças auto-imunes sistemáticas em seres humanos e em ratos6.
Quando as células passam por apoptose, elas expõem a fosfatidilserina (PtdSer) do folheto interno ao folheto externo da membrana. O PtdSer será então reconhecido pelos fagócitos através de receptores de superfície. Mais de uma dúzia de receptores foram identificados para reconhecer e/ou facilitar o engulfment de células apoptóticas. Em geral, há pelo menos três tipos de receptores de superfície envolvidos na depuração celular apoptótica: receptores tethering, reconhecem células apoptóticas; fazer cócegas nos receptores, iniciar o engulfment; os receptores de chaperoning, facilitam o processo inteiro7. As tirosina cinases do receptor TAM (TAM RTKs) consistem em Tyro-3, AXL e Mer e são expressas principalmente por células mielóides do sistema imunológico8. A função primária de TAM RTKs é servir como receptores tethering, facilitando a remoção fagocítica de células apoptóticas e detritos. Nosso grupo tem estudado o afastamento de pilha apoptóticas negociado Tam no ajuste da autoimunidade por muitos anos. A proteína de crescimento protéico dependente de vitamina K 6 (Gas6) e proteína S (prós) vincula e ativa os receptores de Tam9,10. Gas6 é produzido no coração, rins e pulmões. ProS é produzido principalmente no fígado11. TAM reconhece de células apoptóticas de tal forma que o N-terminal de Gas6/ProS se liga ao PtdSer em uma célula apoptótica e o C-terminal de Gas6/ProS se liga aos receptores TAM que ancorados na superfície dos fagócitos. Juntamente com os outros receptores, a engulfment de células apoptóticas ocorre12. Embora o Mer possa se vincular tanto aos ligantes ProS e Gas6, descobrimos que Gas6 parece ser o único ligador para a fagocitose de macrófagos mediada por Mer de células apoptóticas, que podem ser bloqueadas pelo anticorpo anti-Mer13. Os macrófagos são fagócitos profissionais. O afastamento rápido de pilhas apoptóticas por macrófagos é importante para a inibição da inflamação e de respostas auto-imunes de encontro aos antígenos intracelular. A tirosina quinase do receptor de Mer é crítica para o engulfment do macrófago e o afastamento eficiente de pilhas apoptóticas14. No baço do camundongo, Mer expressa principalmente sobre a zona marginal e os macrófagos corpóreos13.
O protocolo aqui apresentado descreve um método básico para induzir a apoptose celular e demonstrar formas de mensurar o processo e a eficiência da eferocitose. Estes protocolos podem prontamente ser adaptados para estudar o macrófagos por outros tipos da pilha no engulfment de pilhas apoptóticas de origens diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A apoptose é um processo de morte celular altamente conservado que envolve muitas cascatas de sinal e induz expressão protéica, secreção e transporte. A apoptose é frequentemente associada a alterações morfológicas celulares17. Células apoptóticas liberam ativamente citocinas e quimiocinas que atraem fagócitos para migrar para o local e iniciar o processo de engulfment, uma via extremamente complexa controle apertado18. Por outro lado, a morte celular necrótica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa no laboratório de Shao é apoiada pela concessão inovativa da pesquisa da faculdade da medicina e da faculdade Júnior concessão do piloto do departamento da medicina interna, Universidade de Cincinnati e concessão DK K01_095067 de NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
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